不同阶段幼龄SD大鼠血液指标差异的探讨

孙 超 黄维芝 孙俊梅 李晓菲 汤连升

(1.山东省药学科学院山东省化学药物重点实验室，济南 250101)(2.山东中医药高等专科学校附属医院，烟台 264199)

随着临床对儿科用药安全理念的加强，儿科药物非临床安全性评价和幼龄动物相关试验越来越受到重视。婴、幼儿期是一个不断发育成长的过程，在生长的不同阶段拥有不同的体征，对药物作用的反馈也存在一定的差异，同样不同发育阶段的幼龄大鼠对于药物的不良反应以及毒性表征亦存在差异[1-2]。不同区域或者GLP条件下成年SD大鼠生物学指标文献报道较多[3-4]，但GLP条件幼龄大鼠尚无建立一套完整的、规范的血液学和血清生化学指标背景数据[5-6]，本研究在幼龄大鼠的不同发育时间段，对大鼠的血生化指标及血液学指标进行采集分析，探究不同发育阶段对血液指标影响，以期构建本中心幼龄大鼠的背景数据，用于试验结果异常数据的解释。

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器

戊巴比妥钠，由济南亿欧生物科技有限公司分装提供；SYSMEX XT-2000IV型全自动血球计数仪，Sysmex Corporation生产；SYSMEX CA1500全自动血凝分析仪，Sysmex Corporation生产；日立7180全自动生化分析仪，日本株式会社日立高新技术生产；SPF级大、小鼠生长繁殖饲料，北京科澳协力饲料有限公司生产。

1.2 动物与饲养条件

取成年性成熟健康SD大鼠60只(用于繁殖幼龄SD大鼠)，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。60只幼龄大鼠来源于不同窝别，雌雄各半，饲养于中心SPF屏障系统内，实验动物使用许可证号SYXK(鲁)2014 0008。饲养条件：饲养间控制温度20～26 ℃，日温差≤4 ℃，湿度40%～70%，换气次数至少8次/h；每笼1只饲养于放有垫料的透明大鼠饲养盒(笼盒尺寸≥500 mm×360 mm×200 mm)，用SPF大小鼠生长繁殖饲料喂养，自由进食和饮水。

1.3 动物分组

将成年雄鼠与雌鼠1∶1合笼，分娩后第4天根据健康状况每窝留取雌、雄胎鼠各半，分娩后第15天按照胎鼠体质量随机分成6、12和16周龄组，每组动物20只，雌雄各10只。幼龄大鼠6、12和16周龄分别相当于人类儿童、青少年和成年时期，大体覆盖了机体发育特征显著的三个时间段[7-9]。

1.4 生物样本的收集和检测

相应组别分别于6、12和16周龄时禁食12 h，按照40 mg/kg体质量剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉取血[10]，然后分别置于添加EDTAK2、枸橼酸钠和促凝剂的一次性负压采血管中，根据要求处理后置于Sysmex XT-2000iv全自动血液分析仪、SYSMEX CA1500全自动血凝分析仪和日立7180全自动生化分析仪进行检测。

1.5 统计方法

计算各测定指标参数的平均值和95%的置信区间，采用SPSS18.0 软件对数据进行统计分析。

2 结果

2.1 幼龄大鼠血常规及凝血主要指标的测定与分析

参见表1、2，结果显示不同周龄间雌性幼鼠的WBC、PLT、APTT、TT和Fbg指标以及雄性幼鼠的LYNPH%、Fbg指标无统计学差异(P>0.05)。6 周龄组的血常规和凝血指标多数指标与12 周龄和16 周龄组比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；12 周龄组仅个别指标与16 周龄组相比有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。统计分析结果表明：幼龄SD大鼠前期发育阶段的血常规及凝血指标与成年时期的SD大鼠指标具有一定差异性。

数据分析表明雌雄幼鼠的大部分血常规及凝血指标呈现一定的时间相关性；12 周龄和16周龄幼鼠的RBC、PLT、HGB指标与6周龄幼鼠相比均出现明显升高现象，个别数据虽无统计学差异，但是亦有升高趋势；NEUT和EO比例随着幼鼠周龄的增加呈现升高趋势，而MONO比例则出现降低趋势。12周龄和16周龄幼鼠的RET细胞数与6周龄幼鼠相比均出现明显降低现象。凝血方面雄性6周龄幼鼠APTT指标出现极显著性降低，其他6周龄幼鼠部分指标与12周龄、16周龄组相比虽有统计学差异，但是各组的平均值差别不大，无太明显的离散性。12周龄幼鼠和16周龄大鼠比较，仅个别指标有统计学差异，其余指标均无明显差异。通过对统计结果的分析判断，处于儿童时期的SD幼鼠的血常规和凝血指标与青少年、成年时期相比有一定的差异性，值得进一步探究，而处于青少年时期的SD大鼠和成年期的指标参数基本一致，数据无明显的离散性；该发现对今后幼鼠试验有一定的参考价值。

表1 雌性幼龄大鼠血常规及凝血指标数据Table 1 Blood Routine and Coagulation Index Data of Young Female Rats

注：6周龄、12周龄组与16周龄组比较*P<0.05，**P<0.01，6周龄组与12周龄组比较，#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

2.2 幼龄大鼠血生化主要指标背景数据的测定与分析

结果参见表3、4，雌性幼鼠的ALT、TC、TG不同周龄间无统计学差异(P>0.05)；雄性幼鼠的ALT、AST、TBIL、TG、CK不同周龄间无统计学差异(P>0.05)。雌雄幼鼠6周龄组的血生化指标大部分数据与12周龄、16周龄组相比有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，而12周龄组仅个别血生化指标与16周龄组相比有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。表明幼龄SD大鼠的血生化指标在不同时间点是有所差异的。

通过数据分析发现雌、雄幼鼠的大部分血生化指标具有一定的时间相关性，且相关性无明显性别差异；雌、雄幼鼠ALP、A/G均呈时间负相关性，TP、TBIL、GLU、BUN、Crea均呈时间正相关性。12周龄幼鼠和16周龄大鼠的ALP、A/G指标与6周龄幼鼠相比均有明显降低现象。12周龄和16周龄组的TP、TBIL、GLU、BUN、Crea指标与6周龄幼鼠相比均有明显升高现象，个别数据虽无统计学差异，但是亦有升高趋势。12周龄幼鼠和16周龄大鼠比较，除个别指标有统计学差异外其余指标均无明显差异。通过对以上统计结果的分析判断，SD大鼠儿童时期的血生化指标与青少年、成年时期相比差异性比较明显，而SD大鼠青少年时期与成年时期相比基本无明显差别。

表2 雄性幼龄大鼠血常规及凝血指标数据Table 2 Blood Routine and Coagulation Index Data of Young Male Rats

注：6周龄、12周龄组与16周龄组比较*P<0.05，**P<0.01，6周龄组与12周龄组比较，#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

表3 雌性幼龄大鼠血生化指标数据Table 3 Blood Biochemical Index Data of Female Young Rat

注：6周龄、12周龄组与16周龄组比较*P<0.05，**P<0.01，6周龄组与12周龄组比较，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，##P<0.01

表4 雄性幼龄大鼠血生化指标数据Table 4 Blood Biochemical Index Data of Male Young Rat

注：6周龄、*P<0.05，**P<0.01，6周龄组与12周龄组比较#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

实验动物的血液学指标和血生化指标是药效、新药评价试验的基础指标，这些基础指标在幼龄动物中尤其匮乏。本次试验得到了本试验室不同时间段幼龄SD大鼠的血液学和血清生化学常用检测指标的正常生理波动的大体范围，初步建立了相应的背景数据，为本中心开展儿科药物的非临床安全性评价提供数据支持。所得数据与部分文献数据[11-13]基本相近，但也存在一定的差异性，初步估计是可能主要由于采集血液样本的动物周龄阶段不同所引起的。从本次研究结果可知，相对于12周龄幼鼠，6周龄幼龄大鼠血液指标与16周龄成年大鼠相比有明显的差异，推测可能周龄越小幼鼠的血液学和血清生化学指标较成年动物的差异性会更明显，这应与幼龄时期机体的发育正处于旺盛阶段有必然的联系。

目前的试验数据基本建立了本中心幼龄SD大鼠不同发育阶段的血液学和血清生化学数据参考范围，可初步用于本中心血液学结果的合理解释。资料显示幼龄犬标准血液学参数指标从出生到青春期有一些特殊的差异[14]，本试验研究结果表明幼龄大鼠亦存在一定的差异。但是，由于受到样本量的限制，尚未建立全面完善的幼龄大鼠血液指标的背景数据，在此希望各实验动物中心或研究中心逐步采集和分享幼龄大鼠血液指标的相关数据，以期建全幼龄大鼠血液学参考范围，为今后开展幼龄大鼠试验的血液学和血清生化学数据分析提供参考范围，为正常生物学变异和儿科新药的药效作用判断提供参考。