鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定

金福源 陶艳华 李成贵 彭会建

（江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所 215200）

鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的，通过临床症状进行初步判断，再根据其流行性和病理变化等初步诊断，确诊还需要利用实验室技术进行检测。许多试验通过一些生物学的实验技术，RT-PCR、血清学试验、核苷酸测序等进行分离鉴定病毒。传统的病毒分离与鉴定方法对IBV 进行诊断会更加准确，并且许多研究利用分离得到的病毒株可以研发出新型的疫苗和诊断试剂盒，为未来的预防和治疗奠定基础。

1 材料

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

SPF 鸡胚（山东济南斯帕法斯家禽有限公司）。

1.1.2 试验病料

取肾、肺、气管等组织器官，或者急性期病鸡气管渗出物，制成悬浮液。（每毫升加青霉素和链霉素各1 万IU，置4℃冰箱过夜，以抑制细菌污染）。

1.1.3 试验仪器和试剂

仪器：电泳仪；紫外灯仪；基因扩增仪；单人净化操作台；37℃恒温箱；台式离心机；孵化机。

生化试剂Trizol Reagent；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、胶回收试剂盒均；琼脂糖。胰蛋白酶 （浓度为1.47%）；鸡红细胞（浓度为0.8%）；青霉素和链霉素（浓度为940IU）；动物疫病基因芯片诊断试剂盒。

2 试验方法

2.1 动物接种试验

将采集到的病料加入灭菌生理盐水中进行细细研磨，放入离心机中12000r/min 离心20min；之后再将上层清液用滤过膜过滤除菌，接种20 枚9 日龄SPF 鸡胚，在尿囊腔中注入0.1ml/胚。观察鸡胚死亡情况，舍去一日内死亡的鸡胚，对1～6d 内死鸡胚进行打蛋观察鸡胚的病变[1]。无菌条件下收集1～6d 内死鸡胚的尿囊液，接种10 日龄SPF 鸡胚20 枚，连续传3 代，再传至10 代进行备用。分离第3 代毒尿囊液，用肌肉注射的方式接种20 只SPF 鸡，0.1ml/只，观察SPF 鸡的发病率和死亡率，对死亡鸡进行剖检并观察病理变化。

2.2 毒价测定

第3 代分离毒尿囊液用经灭菌后的生理盐水依次作10 倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7，4 个稀释度分别接10～11 日龄SPF 鸡胚10 枚，0.1ml/胚，孵育至144h。24h 以内死亡的鸡胚舍去，根据接种后24～144h 内鸡胚死亡的数量及144h 活胚中有特异性病理变化的鸡胚总数计算毒价。

2.3 HA 试验

IBV 在鸡胚中可干扰NDV-B1 株血凝素的产生[2]。取9～11日龄鸡胚20 枚，分两组，一组先尿囊液进行接种被检IBV 鸡胚液；另一组作为对照。10～18h 后两组同时进行尿囊内接种NDV-B1，孵化36～48h 后，置鸡胚与4℃8h，取鸡胚液做HA。

间接HA 试验阳性样品用兔抗鸡IBV 阳性血清测定血凝抑制（HI）效价。

2.4 RT-PCR 检测

2.4.1 RNA 提取

（1）取被测样品100μl，加300μlTirzol 裂解液，上下颠倒混匀，冰上静置15min[2]；（2）加入氯仿后充分混匀，放在冰上静置10min，然后4℃、12000r/min 离心20min；（3）取上清液250μl，加入250μl 异丙醇，充分混匀，置于冰上15min，然后4℃、12000r/min 离心20min；（4）舍去上清液，加入75%的乙醇1ml，然后4℃，12000r/min 离心10min，舍去上清液，放置5min；（5）加入15μlddH2O 除去沉淀，此时得到产物就是RNA 溶解液。

2.4.2 RT-PCR 扩增体系

PCR 扩增体系，见表1。

表1 PCR 扩增体系

2.5 序列比对

将测序获得的核苷酸序列与核苷酸序列数据库进行比对分析[3]。

3 试验结果

3.1 动物接种试验结果

初代接种的鸡胚，孵化至19d，可使少量鸡胚发育受阻，有个别死亡的情况，而多数的鸡胚能存活。鸡胚连续传至三代后，鸡胚便出现规律性死亡现象，剖检死鸡胚可见鸡胚蜷缩、矮小，出现“侏儒胚”的典型症状。临床病料样品接种第10代的9～11 日龄SPF 鸡胚，接种后1～2d 内鸡胚全部死亡。收集死亡鸡胚尿囊液作为分离毒株。

3.2 毒价测定结果

设置10-4、10-5、10-6、10-74 个稀释梯度组，观察鸡胚死亡情况及特异性病痕的鸡胚数量。如表2 所示，根据Reedmuench 法计算，得出该分离病毒的毒价为10-4.8/0.1ml。

表2 毒力测定结果

3.3 HA 试验结果

试验组鸡胚液有49%以上HA 滴度在1:20 以下，对照组91%以上鸡胚液HA 滴度在1:40 以上[2]。

分离出来的毒株进行血凝试验，其中1%的鸡红细胞不出现凝集。病料的上清液接种鸡胚，观察鸡胚存活情况是全部能存活。通过胰酶处理之后，血凝能够被IBV 阳性血清抑制，HI效价在1：24～1：28；第一代的尿囊液进行直接HA、间接HA试验，得到的结果均为阴性，并且胚体均发育正常，第二代到第十代第的尿囊液进行直接HA 试验，试验的结果均为阴性，间接HA 试验的结果均为阳性。该病毒在鸡胚上传至第三代时，死鸡胚或侏儒胚，随传代次数的增加萎缩症状呈现地越来越明显。鸡胚接种生理盐水后，尿囊液都没有出现红细胞凝集的现象，对照组鸡胚的尿囊液平均HA 效价在1：28.3 之上，试验组的平均HA 效价在:1:24.6 之下，说明分离毒株干扰NDV 的增值。接种分离毒株的数量越多，干扰率会越高。从而初步判断该尿囊液中分离物中有IBV。

3.4 RT-PCR 检测结果

通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR 扩增产物，可观察到在427bp 处有特异的扩增条带，根据相关的报道分析可知[4]，表明分离毒为IBV，参见附图。

3.5 分离毒株的序列分析结果

通过核苷酸序列的对比 [5]可以得到毒株基因的核苷酸序列与国内广泛使用的欧洲呼吸型疫苗株H52、H120 的各自的同源性可达到78.5%和78.7%；与美国呼吸型、肾型代表毒株M41、Holte 的同源性分别是78.9%和79.1%；与澳大利亚呼吸型株T 的同源性是78.3%；与国内呼吸型疫苗株W93 的同源性为78.5%；与变异株5/91 的同源性为98.7%；同腺胃型毒株CK/CH/LDL/97I 的同源性是75.5%；与台湾地区的分离病毒株TW97-4 的同源性是78.5%。HP-W 株S1 基因编码氨基酸的序列与变异株5/91 的同源性达97.2%，同其他毒株氨基酸序列的同源性都在79%之下。通过软件分析可得该分离病毒株与现有的肾型、呼吸型疫苗株的亲缘性都比较远，与变异株5/91 有很近的亲缘性。

附图 RT-PCR 结果

4 讨论

鸡传染性支气管炎的确定需要先通过临床症状进行初步判断，再根据其流行性和病理变化等初步诊断，确诊还需要利用实验室技术进行检测。本次试验通过一些生物学的实验技术，RT-PCR、血清学试验 [5]等进行分离鉴定病毒，最后确定该养殖场鸡群发病病因是IBV。传统的病毒分离与鉴定方法对IBV进行诊断会更加准确，并且利用分离得到的病毒株可以研发出新型的疫苗和诊断试剂盒，为未来的预防和治疗奠定基础。由于IBV 血清型比较多且病毒变异速度较快，使用疫苗前要对当地流行的IBV 血清型进行调查，这样得到的诊断和之后的防治才能更准。

各种年龄的鸡群都易感IBV，鸡舍由于饲养管理不当、养殖密度大、通风不佳、饲料营养不均衡等原因都会发生IBV 的感染。现在IB 还没有特效药品，所以对其病的防控措施方法是加强饲养管理和疫苗接种。阻止应激反应，保证饲养环境和饲料的卫生。预防该病的免疫程序一般为7～10 日龄弱毒疫苗首免，30 日龄弱毒疫苗二免，肌肉注0.4ml/只，并且要根据当地该疫病流行情况选用合适的疫苗毒株。外来的鸡群应先隔离观察一段时间，无症状的情况下再混入鸡舍饲养。