Cullin7表达下调对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

介卫华 赵 彬 李爱红

河南省漯河市中医院内三科(462000)

背景：结肠癌为常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高。Cullin7定位于染色体6p21.1，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。目的：探讨Cullin7表达下调对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响。方法：采用qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测结肠癌组织、癌旁组织中Cullin7 mRNA和蛋白表达。以siRNA沉默Cullin7基因，并转染结肠癌HCT116细胞，qRT-PCR和蛋白质印迹法检测沉默效果。CCK-8法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，蛋白质印迹法检测cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表达。以siRNA Cullin7联合Wnt信号通路抑制剂FH-535处理结肠癌细胞，流式细胞术检测细胞凋亡情况，蛋白质印迹法检测cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表达。结果：结肠癌组织中Cullin7 mRNA和蛋白表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。与对照组相比，siRNA Cullin7 1组、siRNA Cullin7 2组、siRNA Cullin7 3组Cullin7 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05)，尤其是siRNA Cullin7 2组。与对照组相比，沉默Cullin7表达后，结肠癌细胞增殖活性明显下降，细胞凋亡率明显增加，cleaved caspase-3蛋白表达明显上调，β-catenin、C-myc蛋白表达明显下调(P<0.05)。与siRNA Cullin7 2组相比，联合Wnt信号通路抑制剂FH-535后，结肠癌细胞凋亡率明显增加，cleaved caspase-3蛋白表达明显上调，β-catenin、C-myc蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论：Cullin7基因参与了结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡，沉默Cullin7可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

结肠癌为常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高，复发和转移是导致临床治疗失败的重要原因[1-2]。因此，寻求早期能够阻断癌细胞浸润和转移的靶向分子，对于结肠癌的临床治疗具有一定意义。Cullin7定位于染色体6p21.1，具有高度保守的Cullin结构域，为泛素连接酶亚基，在多种恶性肿瘤(如乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、胰腺癌、卵巢癌等)中高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[3]。已有研究[4]结果表明，与Cullin7低表达的肝癌患者相比，高表达的肝癌患者的预后不良。目前对于Cullin7在结肠癌的发生、进展、浸润和转移中的作用尚不明确。本研究采用siRNA沉默结肠癌细胞株中Cullin7表达，并观察Cullin7在结肠癌细胞增殖、凋亡中的作用，旨在分析其机制，从而为临床结肠癌的治疗提供新的靶点。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人结肠癌细胞株HCT116(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，编号TCHu99)。Cullin7 Human siRNA(OriGene Technologies)，其中Cullin7 1-siRNA正义链序列：5’-CAA GCA GCA UCA UGA GAA ACC-3’，反义链序列：5’-UUU CUC AUG AUG CUG CUU GGA-3’；Cullin7 2-siRNA正义链序列：5’-GAG CGA GAA GGA AGA GGA AGC-3’，反义链序列：5’-UUC CUC UUC CUU CUC GCU CUU-3’；Cullin7 3-siRNA正义链序列：5’-GAU CGA AGA CCA CAG ACG AAC-3’，反义链序列：5’-UCG UCU GUG GUC UUC GAU CUG-3’；Cullin7阴性对照正义链序列：5’-AGU GAG AAC CGC ACA GAC CAA-3’，反义链序列：5’-UCU CUU GGU AUG CGG UCU GUC-3’；脂质体LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(碧云天生物技术研究所)；兔抗人Cullin7、cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白抗体、羊抗兔HRP标记的二抗(碧云天生物技术研究所)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Wnt信号通路抑制剂FH-535(美国Abcam公司)。

二、方法

1. 组织标本：标本源自2015年1月—2018年1月于河南省漯河市中医院接受手术治疗的15例结肠癌患者，诊断均经病理检查证实，且术前患者均未接受过化疗等相关肿瘤治疗。15例结肠癌组织和相应癌旁正常组织(取自距肿瘤边缘>5 cm处)均于术后30 min内置于液氮罐中冻存。标本使用前均取得患者的知情同意，研究方案通过漯河市中医院伦理委员会的审批。

2. 细胞培养、转染和分组：转染前24 h，取对数生长期细胞并调整细胞密度为1×104个/mL，接种于6孔板。将细胞随机分为siRNA Cullin7 1组、siRNA Cullin7 2组、siRNA Cullin7 3组、阴性对照组、对照组。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，每孔2 mL，当细胞达80%以上融合度时，更换为无血清无双抗的培养基培养。依据LipofectamineTM2000说明书，采用无血清无双抗培养基分别稀释LipofectamineTM2000和siRNA(Cullin7 1-siRNA序列、Cullin7 2-siRNA序列、Cullin7 3-siRNA序列、Cullin7阴性对照序列、空载体)至所需浓度，混匀，静置20 min，加入预先采用无血清无双抗的培养基培养1 h的细胞中，培养6 h后，更换为完全培养基继续培养。

3. qRT-PCR法检测Cullin7 mRNA表达：收集结肠癌及其相应癌旁正常组织以及各组结肠癌细胞，以Trizol试剂提取细胞总RNA，然后反转录生成cDNA。采用BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)试剂盒，选取2 μL cDNA于20 μL反应体系行qRT-PCR。循环条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，由上海英骏生物技术有限公司设计引物序列。Cullin7(NM_001168370.1)上游序列：5’-CCT ACC TGA GGG GCA CTT TG-3’，下游：5’-ATC TTG AGG ACC CCT CCT GG -3’，产物大小为187 bp；GAPDH(M17851.1)上游引物：5’-GAG CCA CAT CGC TCA GAA CAC-3’，下游：5’-TCA CAA GCT TCC CGT TCT CA -3’，产物大小为228 bp。采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达水平。

4. 蛋白质印迹法检测Cullin7蛋白表达：收集结肠癌及其相应癌旁正常组织以及各组结肠癌细胞，常规方法提取蛋白质，调整各样本蛋白总量，行10% SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜，3% BSA阻断1 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，洗膜后添加二抗(1∶3 000)，摇床上摇动1 h，Bio-Rad凝胶成像系统成像拍照，以β-actin蛋白条带灰度值为内参进行半定量分析。

5. CCK-8法测定细胞活力：取对照组、阴性对照组、siRNA Cullin7 2组细胞并调整细胞密度为1×104个/mL，接种于96孔板，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，待细胞融合度达70%～80%时，进行转染实验。转染后12 h、24 h、48 h、72 h，每孔分别加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后上酶标仪测定450 nm波长处的每孔吸光度(A)值，以空白对照组调零，计算抑制率。

6. 流式细胞仪检测细胞凋亡情况：收集转染48 h的对照组、阴性对照组、siRNA Cullin7 2组细胞，以胰酶消化，1 000×g离心5 min，收集并重悬细胞，1 000×g离心5 min，加入500 μL结合液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC，然后加入5 μL PI，混匀，室温孵育10 min，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

7. 蛋白质印迹法检测各组cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白表达：取对照组、阴性对照组、siRNA Cullin7 2组细胞，采用蛋白质印迹法检测cleaved caspase-3(工作浓度为1∶2 000)、β-catenin(工作浓度为1∶2 000)、C-myc(工作浓度为1∶3 000)蛋白表达，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。

8. Wnt信号通路抑制剂对沉默Cullin7结肠癌细胞增殖、凋亡的影响：取稳定转染siRNA Cullin7 2组的结肠癌细胞，并分为两组，其中一组给予正常培养，另一组在培养液中加入终浓度为20 μmol/L的Wnt信号通路抑制剂FH-535。培养24 h后，以流式细胞术检测细胞凋亡情况，蛋白质印迹法检测cleaved caspase-3(工作浓度为1∶2 000)、β-catenin(工作浓度为1∶2 000)、C-myc(工作浓度为1∶3 000)蛋白表达。

三、统计学分析

结 果

一、Cullin7在癌旁正常组织和结肠癌组织中的表达

与癌旁正常组织相比，结肠癌组织中Cullin7 mRNA和蛋白表达明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)(图1、表1)。

二、siRNA Cullin7下调HCT116细胞中Cullin7的表达

与对照组相比，siRNA Cullin7 1组、siRNA Cullin7 2组、siRNA Cullin7 3组Cullin7 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)(图2、表2)，其中siRNA Cullin7 2组下降幅度最大，故后续实验选择siRNA Cullin7 2组进行研究。

1：癌旁正常组织；2：结肠癌组织

组 别例数mRNA表达蛋白表达癌旁正常组织150.24±0.020.16±0.04结肠癌组织150.84±0.060.43±0.04t值16.4328.267P值0.0000.001

1：对照组；2：阴性对照组；3：siRNA Cullin7 1组；4：siRNA Cullin7 2组；5：siRNA Cullin7 3组

图2siRNA Cullin7下调HCT116细胞中Cullin7蛋白表达(蛋白质印迹法)

表2siRNA Cullin7下调HCT116细胞中Cullin7 mRNA和蛋白表达

三、siRNA Cullin7抑制HCT116细胞增殖

对照组、阴性对照组、siRNA Cullin7 2组之间HCT116细胞A值相比差异有统计学意义(F=4.029，P<0.05)；随着时间延长，三组A值呈增长趋势，差异有统计学意义(F=95.648，P<0.05)；且处理因素与时间之间存在交互作用(F=2.579，P<0.05)(图3)。

四、siRNA Cullin7诱导HCT116细胞凋亡

转染48 h后，对照组、阴性对照组和siRNA Cullin7 2组的细胞凋亡率分别为4.49%±0.03%、5.48%±0.05%、21.38%±0.74%，其中siRNA Cullin7 2组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)(图4)。

培养时间

五、siRNA Cullin7对HCT116细胞中cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc表达的影响

与对照组相比，siRNA Cullin7 2组HCT116细胞中cleaved caspase-3蛋白表达明显增加，而β-catenin、C-myc蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)(图5、表3)。

六、抑制Wnt信号通路协同沉默Cullin7对HCT116细胞凋亡的影响

与siRNA Cullin7 2组相比，联合Wnt信号通路抑制剂FH-535处理后，结肠癌细胞凋亡率明显增加(36.14%±1.02%对23.92%±0.82%)，差异有统计学意义(P<0.05)(图6)。

七、抑制Wnt信号通路协同沉默Cullin7对cleaved caspase-3、β-catenin、C-myc表达的影响

与siRNA Cullin7 2组相比，联合Wnt信号通路抑制剂FH-535处理后，cleaved caspase-3蛋白表达明显增加，β-catenin、C-myc蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)(图7、表4)。

讨 论

Cullin7为Cullin蛋白家族中较晚开始研究的成员，基因高度保守，其本身并不是促癌基因或抑癌基因，主要通过底物蛋白影响细胞信号通路，并进一步诱导肿瘤的形成[5-6]。有研究显示，Cullin7在绒毛膜癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞中高表达，为一种致癌基因，与肿瘤的增殖、凋亡、恶性进展等存在一定的联系，以Cullin7为靶点的药物和基因治疗也引起越来越多的重视[7]。Cullin7过表达在肝细胞癌的发病机制和进展中起有重要作用，可能是肝细胞癌管理的重要标志物，沉默Cullin7可显著降低肝癌细胞迁移、侵袭和转移的能力[8]。此外，有研究[9]发现Cullin7高表达与上皮性卵巢癌患者预后不良密切相关，并可下调p53表达，促进卵巢癌细胞增殖和侵袭。Men等[10]发现，Cullin7在肺癌中过表达是肺癌细胞增殖所必需的条件。本研究结果显示，Cullin7 mRNA和蛋白在结肠癌组织中的表达均明显高于癌旁正常组织，提示Cullin7表达增高在结肠癌的发生中可能起一定的促进作用。

A：对照组；B：阴性对照组；C：siRNA Cullin7 2组

1：对照组；2：阴性对照组；3：siRNA Cullin7 2组

组 别cleaved caspase-3β-cateninC-myc对照组0.27±0.050.67±0.060.52±0.06阴性对照组0.26±0.070.69±0.050.54±0.05siRNA Cullin7 2组0.43±0.070.31±0.050.37±0.04F值6.65947.86010.090P值0.0300.0000.012

A：siRNA Cullin7 2组；B：siRNA Cullin7 2+FH-535组

1：siRNA Cullin7 2组；2：siRNA Cullin7 2+FH-535组

组 别cleaved caspase-3β-cateninC-mycsiRNA Cullin7 2组0.39±0.050.38±0.050.41±0.06siRNA Cullin7 2+FH-535组0.63±0.060.15±0.030.17±0.04t值5.3226.8325.765P值0.0030.0010.002

RNA干扰主要应用于转录后基因表达调控，广泛用于目前的科学研究。结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病原因比较复杂，机制目前尚不明确。因此，寻求一种新的治疗靶点对结肠癌的治疗、预后具有一定的临床价值[11]。本研究结果显示，转染Cullin7 siRNA 48 h后，结肠癌细胞中Cullin7 mRNA和蛋白表达均明显低于阴性对照组和对照组，提示siRNA可特异性下调结肠癌HCT116细胞中Cullin7表达。已有研究显示，Cullin7结构发生改变时，会导致细胞内泛素水平失衡，引起细胞凋亡紊乱，造成恶性增殖[12]。本研究进一步采用CCK-8法检测转染Cullin7 2-siRNA后的细胞增殖情况，结果显示siRNA Cullin7 2组在转染24 h、48 h和72 h的A值均明显低于对照组和阴性对照组；流式细胞术示siRNA Cullin7 2组细胞凋亡率明显高于对照组。提示阻断Cullin7表达可有效抑制结肠癌HCT116细胞增殖，并诱导细胞凋亡。此外，转染Cullin7 siRNA后，凋亡蛋白cleaved caspase-3表达显著增加，表明下调Cullin7表达可通过caspase信号通路诱导结肠癌HCT116细胞凋亡。

Wnt/β-catenin为一种比较保守的信号通路，从低等的果蝇到高等的哺乳动物中均具有高度保守的同源性，与细胞生长、凋亡、黏附存在一定的联系[13-14]。β-catenin是该经典通路的关键蛋白，通过调控包括C-myc等在内的下游靶基因的转录和表达影响癌细胞的生长过程[15]。β-catenin在多种恶性肿瘤细胞中过表达，抑制其表达可逆转恶性肿瘤的表型。潘安萍等[16]的研究发现，沉默β-catenin表达可促进胃癌MGC-803细胞凋亡，阻滞细胞周期，降低细胞侵袭转移能力，其作用机制可能与影响Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白表达有关。本研究结果显示，沉默Cullin7表达后，β-catenin、C-myc表达明显降低，cleaved caspase-3表达明显增加；联合Wnt信号通路抑制剂FH-535后，β-catenin、C-myc表达进一步下调，cleaved caspase-3表达进一步上调，细胞凋亡率明显增加。提示下调Cullin7表达可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，发挥抑制结肠癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

综上所述，Cullin7基因参与了结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡，沉默Cullin7表达可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，表明Cullin7有望成为结肠癌基因治疗的新靶点。然而，肿瘤发生、转移是一个多因素、多阶段的复杂过程，涉及多种基因和多种信号传递的过程，尚存在许多未知的机制需行进一步研究。

致谢本实验均在漯河市医学生物工程重点实验室完成，在此表示感谢！