魔芋中黄酮类化合物的提取工艺及挥发油成分研究

田梦南，周秀秀，周欣，王志花，靳素荣

（武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北武汉430070）

魔芋（konjac），学名“蒟蒻”，又称为蛇头草、花杆莲、鬼芋子等，是多年生天南星科属草本植物。它既是一种功能性的蔬菜[1]，又是功能性的药膳食品[2-3]，具有降低血脂和血糖[4]、清除氧自由基[5-6]、抗脂质过氧化损伤[7]、治疗心血管疾病等作用[8-9]。魔芋中含有多种活性成分，其中黄酮（flavones）种类众多，功能不尽相同，其活性成分可以改善血液循环，降低胆固醇等，已被用于心血管疾病方面的临床治疗[10]。此外魔芋中还含有挥发油成分，具有抑菌、消炎、抗肿瘤、杀虫、驱虫等生物活性，可用于医药、卫生、食品、保健、农林预防等方面[11-13]。目前，对植物中黄酮和挥发油成分的研究已相当深入，但对魔芋成分的研究仍不系统，不完善。

本文采用甲醇-超声辅助提取法提取魔芋中黄酮类化合物，结合单因素试验和响应曲面法[14]，优化黄酮类化合物的提取工艺，探索最佳的提取工艺条件。通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术[15]鉴定魔芋中挥发油的化学组成和相对含量，比较不同魔芋样品中挥发油成分的差异性。这为魔芋的分离和应用提供了试验依据以及理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红魔芋和金珠2号，采自湖北恩施。魔芋块茎洗净后分别将皮和肉切片分离，经干燥、粉碎，过40目分样筛，收集魔芋皮和魔芋粉，备用。

芦丁标准品：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙醚、亚硝酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硝酸铝（分析纯）：上海新宝精细化工厂。

1.2 仪器与设备

PS-D40A超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；FA2004B电子天平（d=0.1 mg）：上海越平科学仪器有限公司；手动移液器：艾本德（上海）国际贸易有限公司；UV5800PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；TD6M台式多管低速离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；QP2010plus气相色谱-质谱联用仪：岛津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魔芋中黄酮类化合物的提取

精确称取魔芋样品1.0g（精度0.1mg），置于250mL锥形瓶中，料液比1∶30（g/mL），甲醇浓度 70%，40℃下超声提取3次，每次30 min。离心，滤膜抽滤并合并滤液，加压浓缩，得黄酮类化合物的提取液。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

精确称取芦丁标准品3.0mg（精度0.1mg），用70%甲醇溶液定容至 25mL。依次移取 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL标准液，依次加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，摇匀，反应10 min。再依次加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀，反应10 min。再依次加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液和0.4 mL蒸馏水，摇匀，70%甲醇溶液定容至25 mL。放置10 min，510 nm处分别测定不同浓度梯度的芦丁标准液的吸光度。以浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线见图1。线性拟合得线性回归方程为：A=9.24C+2.87×104，R2=0.999 7。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.3 魔芋中黄酮类化合物含量的测定

式中：n为稀释倍数；c为测定的黄酮类化合物浓度，mg/mL；m为魔芋粉的质量，g；ω为魔芋中黄酮类化合物的提取量，mg/g。

1.3.4 单因素试验

以黄酮类化合物提取量为优化指标，选取甲醇浓度50%、60%、70%、80%、90%，料液比 1∶20、1∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50（g/mL），超声时间 20、25、30、35、40、50 min，超声温度 30、35、40、45、50、55、60 ℃，提取级数1级、2级、3级、4级、5级5个影响因素进行单因素试验，考察各因素对魔芋黄酮类化合物提取量的影响。

1.3.5 响应曲面法优化黄酮类化合物的提取工艺

根据单因素试验的结果，确定响应曲面法的自变量影响因素为超声时间、超声温度、甲醇浓度和料液比。以黄酮提取量为响应值，进行四因素三水平的响应曲面分析，因素水平见表1。

表1 响应面试验因素和数值水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnke experiments

在Design-Expert 8.0软件中，根据n中心组合原理，确定了29组有效的试验条件，其中有25组是中心试验，4组是重复试验条Box-Benhnke件，用于评估试验过程中产生的系统误差。

1.3.6 验证数学模型并检验提取工艺的稳定性

在最佳工艺条件下平行提取6次，测定魔芋中黄酮类化合物的含量，考查数学模型建立的是否合理和工艺条件的重复性是否良好。

1.3.7 魔芋中黄酮类化合物的含量分析

选取金珠2号和红魔芋两个魔芋品种为研究对象，最佳工艺条件下分别测定金珠2号（粉和皮）和红魔芋（粉和皮）4个样品中黄酮类化合物的含量，分析品种及组织间含量的差异性。

1.3.8 魔芋中挥发油成分的气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

准确称取金珠2号（粉和皮）和红魔芋（粉和皮）1.0 g（精度0.1 mg）分别置于4个250 mL锥形瓶中，料液比为1∶40（g/mL）的甲醇溶液，40℃下超声提取3次，超声时间 30 min[16]，合并滤液，低速离心，0.22 μm滤膜抽滤，收集滤液，加压浓缩，得黄褐色挥发油浸膏。8 mL乙醚萃取分离，高速离心，收集上清液，进行GCMS分析。

色谱条件：DB-5石英毛细管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；FID 检测器；进样温度 250℃；载气为 He；流速为1 mL/min；升温设置为保持50℃，3 min后以6℃/min的速率匀速升至90℃，保持1min后以8℃/min的速率匀速升至220℃，保持2 min后以8℃/min的速率匀速升至250℃，继续保持2 min；进样模式为不分流；进样量 0.5 μL。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源；离子源温度250℃；电子能量70 eV；质量范围40 amu～600 amu。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 甲醇浓度对魔芋中黄酮提取量的影响

以黄酮类化合物提取量为优化指标，选取甲醇浓度 50%、60%、70%、80%、90%进行单因素试验，试验结果如图2所示。

图2 提取剂浓度对黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction content

由图2可知，甲醇浓度由50%增加到80%时，黄酮类化合物的提取量会随着提取剂浓度的增加而提高。当80%达到最大值之后，黄酮类化合物的提取量会随甲醇浓度的增加而降低。因此，选择80%甲醇溶液为最佳提取浓度。

2.1.2 料液比对魔芋中黄酮提取量的影响

以黄酮类化合物提取量为优化指标，选取料液比1 ∶20、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50（g/mL）进行单因素试验，试验结果如图3所示。

图3 料液比对黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of ratio of solid to liquid on extraction content

由图3可知，适当增大料液比，可提高魔芋中黄酮类化合物的提取量，料液比为1∶40（g/mL）时，黄酮类化合物的提取量最大，达到1.70 mg/g，料液比再增加，黄酮类化合物的提取量呈现下降的趋势。因此，选择1∶40（g/mL）为最佳料液比。

2.1.3 超声时间对魔芋中黄酮提取量的影响

以黄酮类化合物提取量为优化指标，选取超声时间 20、25、30、35、40、50 min 进行单因素试验结果如图4所示。

图4 超声时间对黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction content

由图4可知，超声时间由20 min延长到30 min时，黄酮类化合物的提取量会随着超声时间的延长而提高。30 min时达到最大值，之后，黄酮类化合物的提取量会随超声时间的延长而降低。从工业角度来说，降低超声时间可减少能量消耗。因此，选择超声30 min为最佳超声时间。

2.1.4 超声温度对魔芋中黄酮提取量的影响

以黄酮类化合物提取量为优化指标，选取超声温度 30、35、40、45、50、55、60 ℃进行单因素试验结果如图5所示。

图5 超声温度对黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on extraction content

由图5可知，黄酮类化合物的提取量随着超声温度的升高而增大，45℃时达到最大值，之后，黄酮类化合物的提取量则随着温度的上升而下降。因此，选择45℃为最佳超声温度。

2.1.5 提取级数对魔芋中黄酮提取量的影响

以黄酮类化合物提取量为优化指标，选取提取级数1级、2级、3级、4级、5级进行单因素试验，试验结果如图6所示。

图6 提取级数对黄酮提取量的影响Fig.6 Effect of microwave number of times on extraction content

由图6可知，提取级数增加黄酮类化合物的提取量增大，当提取级数大于3时，黄酮类化合物的提取量增幅明显变缓。控制提取级数，可节省能源，增加经济效益。因此，选择3级为最佳提取级数。

由单因素试验结果可知，最佳试验条件为80%甲醇溶液，料液比 1 ∶40（g/mL），超声时间 30 min，超声温度45℃，提取级数3级，魔芋中黄酮类化合物的提取量为1.17 mg/g。

2.2 响应曲面法优化黄酮类化合物提取工艺

影响魔芋中黄酮类化合物提取量的因素有很多个，各影响因素间存在交互作用，因此，选用响应曲面法优化魔芋中黄酮类化合物的提取工艺条件，分析各影响因素的先后次序，确定最佳的提取工艺条件。

2.2.1 方差分析

在单因素试验的基础上，以黄酮类化合物提取量为响应值，确定超声时间、超声温度、甲醇浓度和料液比4个自变量，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，通过Design-Expert软件确定试验，评估试验过程中产生的系统误差，结果如表2所示。

表2 响应面试验表Table 2 Response table of Box-Benhnken experiments

由表2可知，在响应面试验中，当超声时间30min、超声温度40℃、甲醇浓度80%、料液比1∶35（g/mL），魔芋中黄酮类化合物的提取量最大，为1.48 mg/g。该条件不同于单因素最佳试验条件，黄酮类化合物提取量高于单因素试验结果。

利用Design-Expert 8.0软件对表2中的数据进行方差分析，考查各因素的交互作用和影响提取率的先后次序，如表3。

表3 响应方差分析表Table 3 Variance analysis table of Box-Benhnken experiments

由表 3 可得，B、C、B×D、B2、C2对魔芋中黄酮类化合物提取量的影响极其显著（P ＜ 0.01）；D、B×C、C×D对魔芋中黄酮类化合物提取量的影响显著（0.01＜P＜0.05）；其他因素对魔芋中黄酮类化合物提取量的影响不显著。通过比较F值的大小，判定各因素影响的先后次序为：甲醇浓度（C）＞超声温度（B）＞料液比（D）＞超声时间（A）。该模型较好的反映了魔芋中黄酮类化合物提取时各因素之间具有交互作用。

2.2.2 优化提取工艺参数

以黄酮类化合物提取量为响应值，Design-Expert 8.0软件对表3中的试验数据进行多元回归分析，建立响应面优化的数学模型，通过计算数学模型的最优解获得黄酮的最佳提取工艺条件。响应曲面如图7～图9所示。

图7 超声温度和料液比交互作用的等高线图及三维图Fig.7 Contour chart and 3D chart about interaction of temperature and solid-liquid ratio

图8 超声温度和甲醇浓度交互作用的等高线图及三维图Fig.8 Contour chart and 3D chart about interaction of temperature and methanol concentration

图9 甲醇浓度和料液比交互作用的等高线图及三维图Fig.9 Contour chart and 3D chart about interaction of methanol concentration and solid-liquid ratio

由响应三维图7b、图8b、图9b可知，曲面表面弯曲程度不同，说明超声温度和料液比、超声温度和甲醇浓度、甲醇浓度和料液比存在交互作用，各因素对黄酮类化合物提取量的影响不同，交互作用的先后次序为（B×C）＞（C×D）＞（B×D）。由响应等高线图 7a、图8a、图9a可知，在所选的试验参数范围内，存在极值，该极值在响应曲面的中心点附近。

Design-Expert 8.0软件根据响应曲面建立了超声时间（A）、超声温度（B）、甲醇浓度（C）和料液比（D）4个因素的二阶响应模型，数学模型如下：

在多元回归方程中P=0.0004，远远小于0.001，说明自变量因素对魔芋中总黄酮提取量的影响十分显著，且回归方程中多元相关系数R2=0.986 7，CV=10.61%，说明响应值中98.67%的结果均由模型中的自变量因素产生，与实际试验的相关度极高（＞95%），试验过程产生的系统误差较小。由数学模型得到最佳的提取工艺条件为：超声时间35 min，超声温度40℃，甲醇浓度88%，料液比1∶32（g/mL），黄酮类化合物的预测提取量为 1.84 mg/g，误差±0.272。

2.2.3 检验提取工艺的稳定性并验证数学模型的合理性

根据数学模型的最佳提取工艺条件，同时为了增加实际的可操作性，分析6组平行试验结果（如图10），考查最佳工艺的稳定性；对比模型预测的结果与实际值的差距，考查模型建立的合理性。

重复测定6组平行试验并计算黄酮的含量，试验结果依次为 1.76、1.74、1.72、1.77、1.69、1.76 mg/g。由图10直观的反映出6组试验值十分接近，平均偏差为0.028，相对平均偏差为2.37%，说明该工艺条件的稳定性较好，准确度较高。

在此工艺条件下，黄酮类化合物提取量的平均值为1.73 mg/g，数学模型的计算值是1.84 mg/g，相差-0.11 mg/g，在模型允许的误差范围内，说明该模型建立合理。该试验结果高于单因素试验结果（1.17 mg/g）和响应面试验结果（1.48 mg/g），相比单因素试验结果，优化后的提取工艺条件将黄酮的提取量提高了47.9%，说明该模型确定的最佳工艺条件达到了优化的目的，提高了黄酮类化合物的提取量。因此，通过响应曲面法建立数学模型，实现了优化提取工艺条件的目的。

2.2.4 魔芋样品中黄酮类化合物的含量分析

数学模型确定的最佳工艺条件下分别提取金珠2号（粉和皮）和红魔芋（粉和皮）中黄酮类化合物，计算黄酮的提取量见表4。

表4 魔芋样品中黄酮类化合物的含量Table 4 Content of flavone in jinzhu NO.2 and red konjac

由表4可得，红魔芋中黄酮类化合物的含量高于金珠2号中黄酮类化合物的含量；魔芋皮中黄酮类化合物的含量高于魔芋粉中黄酮类化合物的含量，且皮中黄酮类化合物的含量是粉中的1.3倍～1.5倍。因此，魔芋样品和组织间的黄酮类化合物在含量上存在差异性，为魔芋的遗传育种提供参考依据。

2.2.5 魔芋中挥发油成分的分析

采用甲醇-超声辅助提取法提取金珠2号（粉和皮）和红魔芋（粉和皮）挥发油成分，用乙醚萃取分离后，进行GC-MS鉴定分析，评价不同魔芋样品中挥发油成分在化学组成和相对含量上的差异性。通过挥发油的总离子流图检索得挥发油成分见表5。

表5 魔芋中挥发油成分测定结果Table 5 The determination results of the components of volatile oil from jinzhu NO.2 and red konjac

由表5可知，采用甲醇-超声辅助提取法依次提取金珠2号和红魔芋中挥发油成分，乙醚萃取分离，GC-MS技术鉴定其化学组成，共鉴定28种有效成分，其中6种醇类化合物，12种烷烃类化合物，5种酮类化合物，1种胺类化合物，1种酯类化合物，1种醛类化合物，其它化合物2种。金珠2号粉和皮中分别鉴定出16种和19种挥发油成分，红魔芋粉和皮分别鉴定出20种挥发油成分，其中11种相同的挥发油成分。说明不同的魔芋品种中挥发油成分存在差异性，为魔芋的分类利用和遗传育种提供试验支撑。

对金珠2号和红魔芋中挥发油成分提取分离，发现不同的魔芋品种中挥发油在组成和含量上均存在差异性，该研究拓宽了魔芋的利用途径，根据不同魔芋品种中挥发油成分的不同进行分类利用，对魔芋的遗传育种提供有力的参考价值。

3 结论

采用超声辅助提取法提取魔芋中黄酮类化合物，结合单因素试验与响应面法确定各因素影响黄酮类化合物提取量的先后次序为：甲醇浓度＞超声温度＞料液比＞超声时间，最佳工艺条件为：超声时间35 min，超声温度40℃，甲醇浓度88%，料液比1∶32（g/mL）。在此条件下，黄酮类化合物的提取量为1.73 mg/g，比单因素试验提高了近47.9%。最佳条件下测定金珠2号（粉和皮）和红魔芋（粉和皮）中黄酮类化合物的含量可知，不同魔芋品种和组织中黄酮类化合物的含量存在差异性。采用甲醇-超声辅助提取法提取金珠2号（粉和皮）和红魔芋（粉和皮）中挥发油成分，GC-MS联用技术分析其化学成分，得出不同的魔芋品种及组织间的挥发油成分存在差异性。

人们生活水平日渐提高，功能保健品的需求日益增大，魔芋及其产品得到广泛关注，魔芋中化学成分复杂，性质各异，应用广泛。本论文以魔芋为研究对象，系统地研究其主要化学成分（黄酮、挥发油），采用现代分析技术和手段分析魔芋重要活性成分的含量差异，为全面了解魔芋化学组成及综合利用提供科学依据。