不同蛋白酶制剂对牛肉的酶解效果研究

（呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古呼伦贝尔021000）

我国牛肉酱的品种繁多，但调配型肉酱居多[1-3]，口味不够醇厚，未经完全水解的牛肉成分也不能完全被人体吸收，造成资源的浪费。发酵型牛肉酱是以豆粕、炒小麦、面粉、香菇粉和牛肉为原料，以低盐固态酱油发酵工艺酿造。但发酵中的米曲霉[4-6]并不能充分利用动物蛋白，不利于生成人体易于吸收的氨基酸和小分子肽类，风味物质的形成也受到了限制。

因此，以复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶分别对牛肉进行预处理，在此基础上考察不同蛋白酶制剂对牛肉酶解效果的影响，筛选出适宜蛋白酶。这将为发酵型牛肉酱的风味形成和营养吸收提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

复合蛋白酶（酶活力：2.7×105U/g）、木瓜蛋白酶（2×105U/g）、胰蛋白酶（3.1×105U/g）、风味蛋白酶（0.4×105U/g）：天津春发香精有限公司；生牛肉：超市统一购买。

色谱级甘氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸（分子量：451 Da）、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（分子量：189 Da）：美国Sigma公司；色谱级细胞色素C、抑菌肽和维生素B12：北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱分析仪：日本岛津公司；PHSJ-4A型pH计：上海沪粤明科学仪器有限公司；UV-1200型紫外可见分光光度计：上海美析仪器有限公司。

1.3 牛肉酶解

将牛肉打碎后与水按质量比1∶1混匀，根据表1给出的条件以复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶分别对牛肉进行酶解，酶解过程中进行恒温搅拌操作，各样品均水解3 h。其中复合蛋白酶是杆菌蛋白酶复合体，主酶是碱性蛋白酶，酶活力根据主酶活力定义。

表1 4种蛋白酶酶解的条件Table 1 Four kinds of protease digestion conditions

1.4 牛肉酶解液理化指标的测定

取10 mL酶解的上清液定容至50 mL，得到10%的稀释液。总酸含量按照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》进行测定；氨基酸态氮含量按照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》进行测定；可溶性氮含量按照凯氏定氮法进行测定。

1.4.1 酶解液pH值的测定

过滤酶解液，使用pH计直接测定其pH值。

1.4.2 酶解液蛋白利用率、肽得率和水解度的测定

蛋白利用率：测定酶解液的上清液和牛肉的总氮量，按下列公式计算：

肽得率：测定酶解上清液中的总氮和氨基态氮含量，则肽得率的公式如下：

水解度（degree of hydrolysis，DH）：是国际上测量蛋白水解效果的重要指标之一，指水解过程中断裂的肽键数目占总肽键数目的比例[7]。水解断裂的肽键数可通过甲醛滴定法测定水解释放出的氨基态氮的数目，水解度的计算公式如下：

1.4.3 酶解液中小分子肽分子量分布测定

样品预处理：蛋白酶解上清液经0.22 μm滤膜过滤，用岛津高效液相色谱仪对样品处理液组分进行测定。

色谱条件：色谱柱：Shodex protein KW802.5；检测波长：220 nm；进样量：10 μL；流速：0.5 mL/min；流动相：50 mmol/L 磷酸缓冲液和 0.3 mol/L NaCl（pH=7.0）。

标准品：细胞色素 C（分子量：12 500 Da）、抑菌酶（分子量：6 500 Da）、维生素B12（分子量：14 355 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量：451 Da）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量：189 Da）。以标准蛋白质的相对分子质量的对数（Y）为纵坐标，出峰时间（X）为横坐标的相对分子质量标准曲线。线性回归方程为：

游离氨基酸的定性定量方法：根据各个标准品出峰时间进行定性。以样品中的峰面积外标法进行定量分析。

1.4.4 酶解液中游离氨基酸的测定

溶液的衍生：取样品和标准品溶液各200 μL，加入 100 μL 0.1 mol/L异硫氰酸苯脂乙腈溶液、100 μL 1.0 mol/L三乙胺乙腈溶液，摇匀，在通风橱内放置1 h，加入400 μL正己烷，摇匀，静置10 min，去除上层液体，下层溶液0.45 μm微孔滤膜过滤，进样20 μL。

色谱柱：Aminex HPx-87H Ino Exclusion Column（300 mm×7.8 mm）。色谱条件：检测波长254 nm，流速0.5 mL/min，进样量20 μL。标准品是由不同含量的18种氨基酸混合制成，表2是18种氨基酸标品的含量。

续表2 18种混合标准氨基酸的含量Continue table 2 The content of 18 kinds of amino acids mixture standard

1.4.5 酶解液中鲜味和苦味测定

感官评定的标准溶液配制：苦味：1.2×10-5mol/L奎宁溶液；鲜味：2×10-2mol/L谷氨酸钠溶液。

以含2%样品蛋白的溶液作为品尝对象。评定开始前对10位人员进行专业培训，并且确定本试验的感官评定的标准和注意事项。评定成员单独对样品进行评定，成员之间不进行交流，在评定前和样品之间用清水漱口。采用5分制，评分方法如下：1-无，2－弱，3－一般，4－较强，5－强，分别对样品打分，评价小组打分的平均值作为各个样品的最终分值。

2 结果与讨论

2.1 pH值和总酸含量的测定

本试验选用复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶，分别研究这4种蛋白酶制剂的添加对酶解液pH值和总酸的影响，结果见图1、图2。

图1 酶解液的pH值Fig.1 The pH of the enzymatic hydrolysate

图2 酶解液的总酸含量Fig.2 The total acids of the enzymatic hydrolysate

不同蛋白酶解液pH值和总酸含量变化与牛肉蛋白水解后形成含羰基端的多肽物质和氨基酸有很大的关系。蛋白水解过程是蛋白质在蛋白酶的作用下生成小分子多肽和氨基酸的过程。在此过程中，随着水解的不断进行，水解液中多肽和氨基酸也不断生成，水解液的pH值和总酸含量也跟着发生变化。

由图1、2可知，各酶解液的pH值与空白组差别不大，都在6.6左右，添加蛋白酶的水解的总酸含量比空白组显著性高，其中添加复合蛋白酶的酶解液的总酸含量最高，达到约0.5 g/100 g，添加风味蛋白酶的酶解液的总酸含量最低。

2.2 氨基酸态氮和可溶性氮含量的测定

随着蛋白酶解过程的进行，部分不可溶性蛋白水解成可溶性的多肽和氨基酸，使得酶解液中的氨基酸态氮和可溶性氮含量不断增加，所以氨基酸态氮和可溶性氮含量是评价蛋白酶水解效果的重要指标[8-11]，结果见图3、图4。

图3 酶解液氨基酸态氮的含量Fig.3 The content of amino nitrogen of the enzymatic hydrolysate

由图3、图4可知，4种添加蛋白酶酶解液的氨基酸态氮和可溶性氮含量均高于空白组，而且各个蛋白酶的水解能力也不相同。其中复合蛋白酶的水解能力最高，氨基酸态氮含量高达0.168 g/100 g，可溶性氮含量为0.904 g/100 g，依次是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶。因此，仅从氨基酸态氮和可溶性氮含量来看，复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解牛肉蛋白的能力均较好。

图4 各酶解液可溶性氮含量Fig.4 The content of soluble nitrogen of the enzymatic hydrolysate

2.3 酶解液的蛋白利用率、肽得率和水解度的测定

4种蛋白酶水解效果比较见图5。

图5 4种蛋白酶水解效果的比较Fig.5 Four kinds of proteinase hydrolysis effect comparison

由图5可知，添加蛋白酶的组别的蛋白利用率、肽得率和水解度均高于空白组，说明蛋白酶能较好地水解蛋白。蛋白质利用率：复合蛋白酶的水解效果最好（28.99%），木瓜蛋白酶次之（25.58%），风味复合蛋白酶的水解产物的蛋白质利用率最低（13.64%）；肽得率：复合蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果最好（23.60%和21.09%），风味蛋白酶的水解效果最差（10.50%）；水解度：复合蛋白酶水解产物最高（5.38%），风味蛋白酶水解产物的水解度最低（3.14%）。这表明各种酶由于酶作用位点的特异性，对同一底物牛肉蛋白具有不同的水解能力，而且添加复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解液的水解效果较好。

2.4 酶解液中小分子多肽分子量分布的测定

肽类分子量分布的研究方法最常用SDS-PAGE和高效液相凝胶色谱法，它们都是根据分子量大小对蛋白质以及多肽的分离纯化，但SDS-PAGE分析的是蛋白质亚基的分子质量，而高效液相凝胶色谱则分析完整蛋白质的分子质量[12-14]。本试验采用高效液相色谱法分析酶解液中小分子多肽分子量分布。结果见表3。

表3 各个酶解液蛋白相对分子量分布Table 3 The relative molecular weight distribution of the enzymolysis liquid protein

与空白组相比，在4个酶解产物中多肽的分子质量分布总体表现为，分子量较大的多肽占得比例较小，分子量小的多肽占得比例较大。所以这4种蛋白酶与空白组相比，均能不同程度地水解大分子蛋白质和多肽，但由于这4种蛋白酶作用基团的不同，这4种蛋白酶的水解产物中多肽分子量分布表现出一定的差异性。由表3可知，添加复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的酶解产物中相对分子质量大于5 000 Da的多肽的比例很少，分别为5.36%、6.39%、11.32%，添加风味蛋白酶的酶解液在此范围内的多肽含量较高，占38.49%，这部分肽类由于分子量较大无法进入味蕾细胞，对食品呈味贡献不大。由此可见，前3种酶均能较好地降解牛肉蛋白中相对分子质量大于5 000 Da的片段。小分子量的多肽对于肉香味的生成是极其重要的，分子量在2 000 Da～5 000 Da范围内的多肽产生的肉香味强度最强，在此范围的多肽以添加木瓜蛋白酶的含量最高。而在分子量小于1 000 Da的范围内的多肽略有牛肉香气、稍有苦味但可接受。分子量小于500 Da的小肽在人体中具有重要的生理功能，其分子量的大小对其生理功能具有重要影响。在此范围的小分子多肽含量以复合蛋白酶最好，其次是木瓜蛋白酶。综合比较4个酶解液中各个多肽分子量段分布，以添加复合蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解液较好。

2.5 酶解液中游离氨基酸含量的测定

由表4可以看出，游离氨基酸含量由高到低分别为复合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、空白。而与食品风味息息相关的氨基酸最主要就是鲜味和苦味氨基酸，4个发酵组中复合蛋白酶的鲜味氨基酸含量显著高于其他组别，苦味氨基酸含量较其他组有所降低。由具体的组成可知，添加复合蛋白酶的酶解液的游离氨基酸较其他组别要好。

表4 4种不同酶制剂的添加对游离氨基酸含量的影响Table 4 Analysis of free amino in the four kinds of essential matrix g/mL

2.6 酶解液的感官评定

各个酶解液的感官评价值见图6。

图6 各个酶解液的感官评价值Fig.6 The sensory evaluation value of enzymolysis liquid

酶解产物呈现的味道对产品的质量和风味有着重要的影响，其中苦味是影响酶解产物呈味的重要因素，而鲜味也是其中的一个重要指标，并且这两种味感相辅相成，相互影响，这两种呈味与体系中氨基酸和多肽的含量有很大的关系。本文探索蛋白酶酶解产物的呈味和酶解产物中的成分关系，对酶解产物的应用起到有利的作用。由图6可知，添加复合蛋白酶的酶解液的鲜味最高，其次是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶。在苦味方面，复合蛋白酶的感官评价分值最低，木瓜蛋白酶的最高。由酶解产物的感官评价可知，添加复合蛋白酶的酶解液在鲜味和苦味这两种味感的评价较好，是酶解牛肉的最佳蛋白酶制剂。

3 结论

由于发酵菌种（米曲霉、乳酸菌等）对动物蛋白的利用率较低，通过添加蛋白酶制剂提高原料蛋白的利用率，选用复合蛋白酶[15]、木瓜蛋白酶[16]、胰蛋白酶[17]和风味蛋白酶[18]对牛肉进行水解，通过测定酶解液的理化指标、风味肽分子量分布、游离氨基酸含量等，选出最适宜的蛋白酶。

综合酶解产物的各项指标测定结果，添加复合蛋白酶的酶解液在理化指标方面明显优于其他蛋白酶。在多肽分子量分布方面，分子量2 000 Da～5 000 Da肽段以木瓜蛋白酶的比例最高，达到62.06%，这一部分肽的含量对于肉味的生成是极其重要的，而且此范围内的小肽产生的肉味强度最大；而分子量小于1 000 Da略有牛肉香气、稍有苦味但可接受。分子量小于500 Da的多肽在人体中具有重要的生理功能，其分子量的大小对其生理功能具有重要影响。在此范围的小肽含量以复合蛋白酶最好。在游离氨基酸方面，添加复合蛋白酶酶解液的氨基酸总量最多，其中鲜味氨基酸含量明显高于其他组别，苦味氨基酸含量低于其他组别。综合各项测定结果，复合蛋白酶是较适合酶解牛肉蛋白的酶制剂。

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