MicroRNAs 对精原干细胞自我更新与分化调控的机制研究进展

张林林，马天天，王爱华，靳亚平，汤克琼

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100）

精原干细胞（Spermatogonial Stem Cells，SSCs）是生物体内唯一能将遗传信息传递至子代的成体干细胞，是精子发生的基础。SSCs 通过自我更新和分化保持雄性体内SSCs 和精子数量的稳定，SSCs 增殖活动过强将导致其过度积累，影响正常的精子形成；反之将导致SSCs 的耗竭。因此，自我更新与分化之间的动态平衡对SSCs 群体数量的稳定具有重要作用。SSCs 的调节需要内源因子和外源信号的共同作用[1]，包括RNA 诱导的沉默复合物（RISC）成分和大量MicroRNAs（miRNAs）的表达[2-3]。RISC 组件Dicer 在生殖细胞或支持细胞中丢失，干扰生殖细胞的发育和导致不孕，表明miRNAs 在精子发生过程中具有重要功能[4-5]。

miRNAs 是一类长度为20～25 个核苷酸的非编码内源性RNA，在细胞增殖、分化和凋亡等许多生理过程中起着重要调节作用[6-9]。miRNAs 基因在细胞基因组中高度保守。在细胞核中经RNA 聚合酶Ⅱ的作用，miRNA 基因转录成为具有核苷酸尾和帽子结构的发夹环状原始miRNA（pri-miRNA），之后经核蛋白DGCR8识别并由核酸内切酶Ⅲ—Drosha 剪切成为前体miRNA（pre-miRNA）[10]。pre-miRNA 在输出蛋白—Exportin5与Ran-GTP 复合物体的作用下进入胞浆，由Dicer 酶剪切形成约22 个核苷酸长度的成熟miRNA。成熟miRNA与Argonaute 蛋白及多种酶类结合形成RISC，通过识别靶mRNA 的3´-非翻译区（3´UTR）并与之结合，诱导其切割或翻译抑制[11]。另外，miRNAs 还具有组织和发育时间特异性，可在不同器官组织或发育阶段调控不同基因的表达，因此，miRNAs 可能在精子的不同发育阶段起重要调控作用。

1 miRNAs 参与调控精原干细胞的自我更新与分化

研究表明，人类超过60% 的基因带有miRNAs 结合位点，而许多miRNAs 在雄性睾丸组织中高度或特异性表达，且具有发育和时间特异性，暗示miRNAs 在精子发生过程中发挥着重要作用[12]。近年来，随着SSCs特异性标记基因细胞分选技术、体外培养技术的逐渐成熟以及高通量测序和miRNA 微阵列技术的快速发展，研究人员检测到一些在SSCs 中特异性表达或高表达的miRNAs，并发现miRNAs 可通过靶向相关基因来参与SSCs 自我更新和分化调控过程（表1）。

1.1 与SSCs 增殖相关的miRNAs SSCs 的自我更新受到支持细胞及间质细胞分泌的细胞因子调控，同时也受其自身miRNAs 的影响。作为一种负调控因子，miRNAs 在转录后水平靶向增殖分化相关基因，参与SSCs 自我更新和增殖的调控。

Thy1为SSCs 标记基因。Niu 等[13]研究发现，miR-21、miR-34c、miR-182、miR-183 和miR-146a 等 特 异表达于Thy1+细胞中。其中，抑制miR-21 表达，SSCs凋亡数量显著增多，暗示miR-21 对SSCs 数量的维持具有重要作用。进一步研究发现，miR-21 启动子区具有多个保守的ETS 结合位点，过表达ETV5，miR-21 转录活性显著增强[13]。ETV5 是ETS 转录因子家族的一个成员，其在SSCs 和支持细胞中均有表达。在SSCs 中，ETV5 可调节miR-201、Brachyury 和CXCR4，及 其他已知SSCs 自我更新相关基因（如Bcl6b、Lhx1等）的表达，促进SSCs 自我更新[30]。Etv5基因缺失常常伴有精子进行性缺失或唯支持细胞综合征的产生。因此，伴随着ETV5 在SSCs 中的表达，miR-21 表达水平显著上调，从而维持SSCs 自我更新。另外，在miR-21 增强子区也发现了Pou3f1 和STAT3 的结合位点，提示多种转录因子可增强其转录活性，参与SSCs 的自我更新过程。

转录抑制因子PLZF 由Zfp145基因编码，特异性表达于精原干细胞中。在特异性敲除小鼠实验中发现，Plzf缺失可导致SSCs 进行性减少，细胞凋亡数量增多，因此PLZF 对SSCs 数量的维持具有重要作用[31]。Song 等[14]研究指出，miR-554 可直接靶向Plzf，下调SSCs 自我更新相关基因Gfra1、Vasa和C-Myc等表达，从而抑制SSCs 增殖。另外，部分miRNAs 的表达还受到PLZF 调控。Mu 等[15]研究指出miR-146a为PLZF 的靶基因。miR-146a 通过调控SSCs 自我更新相关基因Cxcr4的表达，参与山羊SSCs 的增殖调控过程。CXCR4 为趋化因子配体12（Chemokine ligand 12，CXCL12）的 受 体，CXCL12 通 过 与CXCR4 结合，磷酸化ERK1/2，并激活下游SSCs 自我更新相关基因C-Myc的表达，促进SSCs 的增殖[32]。由此揭示，PLZF 可通过直接结合miR-146a 的启动子区，间接促进CXCR4 的表达，从而维持SSCs 的自我更新。此外，还有研究指出，在已分化成熟巨核细胞中，PLZF 可直接抑制miR-146 的表达和起始CXCR4 的翻译[33]。推测miR-146 对SSCs 的分化具有重要的作用。然而，Huszar 等[16]研究指出，miR-146 高表达于THY1+/GFRA1+精原细胞并靶向Med1基因。Med1 作为RA的核激素受体异二聚体RARs 和RXRs 的共调节因子，在RA 促进SSCs 分化过程中具有重要的作用。过表达miR-146，Med1及其他SSCs 分化相关基因（如Kit和Sohlh2）的表达均显著性下调，而SSCs 自我更新相关基因（如Plzf与Gfrα1）的表达并无显著性差异，表明miR-146 可抑制SSCs 的分化，参与SSCs 数量的维持[16]。

表1 SSCs 内miRNAs 的表达及功能

Moritoki 等[17]应用microRNA 微阵列分析了隐睾和正常雄鼠睾丸中miRNAs 的表达情况，发现miR-135a 在隐睾雄鼠SSCs 中的表达显著下调，并可靶向FoxO1基因。FOXO1 是叉头转录因子（FOX）家族成员之一。Goertz等[34]研究表明，FOXO1 特异表达于SSCs，通过由细胞质向细胞核转移并聚集而活化，增强RetmRNA 的转录和细胞表面蛋白的表达，促进SSCs 的自我更新。在miR-135a 过表达的SSCs 中，FOXO1 表达下调，揭示其可通过调控FOXO1 的表达参与SSCs 数量的维持。

Li 等[18]研究指出，miR-10b 高表达于Thy+SSCs，可显著下调真核细胞转录因子Klf4 的表达。Klf4 是体细胞重编程中诱导多能干细胞的因子之一，高表达于生殖细胞，参与细胞增殖、分化和胚胎发育的调控[35]。Klf4的表达可导致细胞周期停滞在G1/S 与G2/M 期，从而抑制细胞增殖并促进凋亡[36-37]。过表达miR-10b，Klf4 的表达显著下调，并伴有SSCs 增殖活动增强，揭示miR-10b 对SSCs 增殖活动的维持具有重要作用。

miR-20 与miR-106a 为miRNA17-92 簇家族的成员。He 等[19]研究表明，miR-20 与miR-106a 特异表达于GFRA1+SSCs 中，Stat3和Ccnd1为其 潜在靶基因。转录因子STAT3 是STAT 家族的一员，在胚胎干细胞的自我更新与分化过程中发挥着重要作用，并参与SSCs 分化起始过程。过表达miR-20 与miR-106a，SSCs 标志基因Gfrα1、Pouf1、Plzf、Ret和增殖相关基因Pcna的表达显著增强，Stat3和Ccnd1的表达显著降低，表明miR-20 与miR-106a 可促进SSCs 的自我更新与增殖[19]。此外，Huang 等[20]研究指出，miR-100 也可间接调节STAT3 的表达，促进SSCs 的增殖。

Zhou 等[21]研究表明，miR-663a 在SSCs中的表达量显著高于粗线期精母细胞，且可靶向NFIX基因。NFIX 为核因子I（NFI）家族的一员。NFI 是一种双向转录调控因子，通过调控下游基因的表达从而在不同的组织或细胞中发挥不同功能。研究指出，神经干细胞在由增殖状态转为休眠状态的过程中，NFIX 表达水平显著升高，表明NFIX 在诱导干细胞休眠的过程中具有重要的作用[38]。过表达miR-663a，NFIX 表达水平显著降低，增殖相关基因Pcna和细胞周期调控因子Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1 的表达升高，表明miR-663a 可通过调控NFIX 的表达，促进SSCs 的增殖[21]。

除此之外，miRNAs 还可调控其他相关蛋白的表达，参与SSCs 自我更新和增殖过程。Fu 等[39]研究指出，PAK1可通过PDK1-KDR-ZNF367 和ERK1/2 以及AKT信号通路促进人SSCs 增殖并抑制其凋亡。而沉默PAK1的表达，miR-31-5p 的表达量显著上升，因此miR-31-5p 在调控SSCs 增殖和凋亡方面具有重要作用。后续实验发现，miR-31-5p 可靶向Jazf1基因[22]。JAZF1 是一种具有3 个C2H2 型锌指结构的核蛋白，其在调控SSCs增殖发育过程中的作用机制还需要进一步研究。过表达miR-31-5p，JAZF1 的表达显著降低，并伴有周期调控因子Cyclin A2 的表达下调；且随着miR-31-5p 的表达升高，SSCs 增殖和DNA 合成均受到了不同程度的阻滞，并伴有早期和晚期凋亡细胞数量的增多，表明miR-31-5p 通过抑制JAZF1 的表达参与人SSCs 增殖和凋亡过程的调控[22]。

KIT 受体是第1 个在分化精原细胞表面发现的标志蛋白，且在未分化SSCs 中未见表达，因此可作为哺乳动物SSCs 开始分化的标志。但在SSCs 中检测到了KitmRNA 的表达，因此必定存在某种机制调控KIT 蛋白在SSCs 中的翻译过程[40]。miR-221 和miR-222 属于X 染色体簇miRNAs 家族，可在多种癌细胞中调控KitmRNA 的表达。Yang 等[23]发现，miR-221 和miR-222特异性表达于THY1+SSCs 细胞中，过表达miR-221 和miR-222 可显著拮抗RA 诱导的SSCs 的分化过程，而抑制miR-221 和miR-222 的表达，SSCs 干细胞活性显著下调，说明miR-221 和miR-222 在维持SSCs 自我更新中的重要作用。

Chen 等[24]研究指出，miR-202 高度且特异表达于SSCs中，可直接靶向Rbfox2、Cpeb1、Ercc2和Nid2。其中，RBFOX2 与CPEB1 均为哺乳动物体内保守的RNA 结合蛋白，分别介导组织特异性剪切和靶RNA 的稳定翻译。体外减数分裂模型结果显示，RBFOX2 在 SSCs 分化的起始过程中具有重要作用。抑制miR-202 的表达，SSCs 自我更新相关基因Plzf表达降低，分化相关基因Stral、Dazl和Sycp3的表达均显著升高；而下调Rbfox2基因的表达，分化精原细胞数量显著降低，表明miR-202 可通过介导RBFOX2 的表达，抑制SSCs 分化的起始，维持SSCs 的增殖活性[24]。1.2 与SSCs 分化相关的miRNAs LIN28 是一种保守性的RNA 结合蛋白。Heo 等[41]研究指出，LIN28 可结合miR-let7 前体的发夹结构，抑制DROSHA-DICER 酶的加工处理，从而抑制其成熟，加速其在体内的降解过程。Tong 等[25]研究发现，RA 可显著下调LIN28 的表达，从而减弱其对miR-let7 的抑制作用；RA 处理后，miR-let7的表达上调，并伴有SSCs 自我更新相关基因Ccnd1、Colla2、Mycn以及Myc的表达抑制，表明miR-let7 在介导RA 信号、诱导SSCs 分化的过程中具有重要作用。此外，Tong 等[26]研究表明，MYC 和MYCN 可诱导 mir-17-92（Mirc1）和mir-106b-25（Mirc3）簇miRNAs 的表达，且这些miRNAs 可靶向促凋亡和分化基因如Bcl2l11、Kit、Socs3和Stat3，参与SSCs 自我更新状态的维持。因此，随着miR-let7 的表达上调，Mycn以及Myc的表达也相继受到影响，并接着抑制mir-17-92（Mirc1）和mir-106b-25（Mirc3）簇miRNAs 的表达，从而促进SSCs 的分化。说明在SSCs 分化调控过程中，miRNAs 并非单独起作用，而是存在一个极其复杂的调节网络来参与此过程。

Yu 等[27]研究表明，miR-34c 在成年小鼠睾丸中高度表达并可靶向Nanos2基因。NANOS2 是NANOS 家族一员，富含编码RNA 结合蛋白的锌指结构基序，因其可抑制雄性生殖干细胞的减数分裂过程，因此对SSCs 数量的维持具有重要作用[42]。过表达miR-34c，NANOS2表达受抑制，而SSCs 分化相关基因Nanos3、Stra8和Scp3的表达水平均显著上调。表明miR-34c 可通过调控NANOS2 的表达促进SSCs 的分化。此外，还有研究指出，miR-34c、miR-34b、miR-449a、miR-449b、miR-449c均属于同一家族，具有相似的种子序列，可作用于相同的靶基因[43-45]。因此，miR-34b、miR-449a/b/c 等可能在SSCs 的分化调控过程中也具有重要作用。

CD49f 为SSCs 的特异性标记基因。Niu 等[28]研究指出，miR-204 高度表达于CD49f-细胞中，且可直接靶向Sirt1基因。Sirt1 是Sirtuin 家族一员，在小鼠SSCs 中高度表达，调控FoxOs和Bcl6等的转录活动。在过表达Sirt1 的SSCs 中，SSCs 自我更新和细胞增殖相关基因（如Plzf、Oct4、Myc和Pcna）的表达均明显上调。因此，Sirt1 对维持SSCs 的自我更新具有重要作用[46-48]。过表达miR-204，Sirt1 表达下调，同时伴随着增殖相关基因Plzf、Oct4、Sox2和Myc的表达显著降低[28]。说明miR-204 可通过调控Sirt1 的表达促进SSCs 的分化。

2 调控SSCs 中miRNAs 表达的因素

SSCs 的自我更新与分化是一个动态平衡过程，受到极度复杂的调控网络的调节。精子发生不只受到内源性转录因子调控，SSCs 还是许多细胞因子作用的靶细胞，因此，当内外环境发生改变时，SSCs 内 miRNAs的表达水平也将发生变化。目前，研究较多的细胞因子为GDNF、FGF2、CSF1 和RA。

SSCs 的自我更新依赖于GDNF，GDNF 是由支持细胞分泌的一种细胞因子，属于转化生长因子β家族一员。GDNF 可与Gfra1 和受体酪氨酸激酶Ret 组成的共受体结合，激活下游磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、Ras/细胞外调节蛋白激酶（Ras/ERK）信号通路、Src 家族激酶（SFK）信号通路等多条通路，在SSCs 自我更新的调控过程中具有重要作用[49-51]。其中，SFK 信号的激活可促进SSCs 增殖所必须的特异性基因，如转录因子B 细胞CLL/淋巴瘤6 成员B（Bcl6b）、ETS 变异体5（Erm）和Lim 同源盒1（Lhx1）的表达；而Ras/ERK 1/2 通路的激活可导致cAMP 反应元件结合蛋白1（CREB-1）、活化转录因子1（ATF-1）、cAMP 反应元件调节蛋白1（CREM-1）的磷酸化并促进早期基因c-fos的转录和细胞周期蛋白A 与细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK-2）的表达，从而促进SSCs 的DNA 合成和自我更新。

此外，FGF2 对SSCs 的自我更新也具有重要作用。FGF2 来源于睾丸的各种细胞类型，包括支持细胞、睾丸间质细胞和分化的精子细胞。Ishii 等[52]研究发现，支持细胞分泌的FGF2 与膜上成纤维细胞生长因子受体（FGFR）结合，相继激活SRC/Ras/MEK 通路各因子，并通过磷酸化MAP2K1 激活MAP2K1 信号通路上调Etv 5和Bcl6b的表达；而Etv5 的缺失造成受体酪氨酸激酶Ret 的表达下降，导致SSCs 对GDNF 的应答反应减弱，进一步表明这2 种细胞因子在SSCs 自我更新过程中的重要作用[53]。

与前2 种细胞因子相比，对CSF1 在SSCs 自我更新中的作用知之甚少。研究发现，CSF1 由间质细胞产生，通过作用于SSCs 上的CSF1 受体CSF1R，从而刺激 GFRα1+精原细胞的增殖[54]。

RA 是维生素A 的活性代谢物，在调控SSCs 分化过程中至关重要[55]。研究发现，大鼠和小鼠缺乏维生素A 时，其SSCs 分化过程被阻断，外源注射视黄醇或维甲酸则恢复SSCs 分化过程[49]。进一步研究发现，RA 可通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制GDNF 受体亚基Ret 的表达，并促进其靶向基因（如Stra8、Kit、Ccnd2等）编码的蛋白质表达，直接参与SSCs 的分化过程[34,56]。

miR-100、miR-221、miR-222、miR-146、miR-202-3p、miR-let7 的表达受到细胞因子GNDF、FGF2、CSF1 或RA 的调控；同时，细胞因子GDNF 可通过正向调控转录因子ETV5 和PLZF 来间接调节miR-21 和miR-146a 的表达，说明细胞因子可通过对转录因子的调控间接调节miRNAs 的表达，从而参与到SSCs 自我更新及分化的调控过程中，为研究这些细胞因子对SSCs 作用的分子机制提供其他思路。

3 miRNAs 调控SSCs 增殖与分化的其他方式

综上可知，miRNAs 通过直接和间接调控SSCs 增殖分化相关基因的表达调节SSCs 增殖分化过程。此外，SSCs 自我更新与分化还受到其微环境的调控。SSCs 微环境由SSCs 周围的支持细胞、血睾屏障、血管网及其他体细胞所构成。其中支持细胞及间质细胞是主要组成部分，且上述调控miRNAs 表达的细胞因子（如GDNF、FGF2、CSF、RA 等）均由其分泌，因此研究这些细胞因子的合成和分泌机制及miRNAs 在该过程所发挥的作用，对进一步揭示miRNAs 对SSCs 增殖与分化的影响具有重要作用。

Yang 等[12]研究指出，miR-202-3p 可靶向脂蛋白受体相关蛋白6（Lipoprotein Receptor-Related Protein 6，LRP6）抑制支持细胞增殖分化相关基因Gndf、Scf、Bmp4、Fgf2、Cxcl12等的表达，同时miR-202-3p 的过表达也可促进支持细胞凋亡数量增加。此外，Zhang 等[57]研究指出，miR-1285 可通过AMPK 通路抑制支持细胞的增 殖。miR-133b 和miR-762分别靶向GLI3 和RNF4 促进支持细胞增殖[58-59]。也有研究指出，miR-140-5p/3p 缺失的胚胎，间质细胞数量明显增加[60]。miR-150 可抑制STAR 的表达，降低睾酮的合成，最终影响精子发生[61]。目前，miRNAs 对SSCs 微环境调控方面的研究大多聚焦于miRNAs 对其增殖和凋亡过程的影响，而miRNAs 对支持细胞和间质细胞GNDF、SCF、BMP4、CSF、FGF2、RA 等SSCs 增殖分化相关细胞因子分泌的调节及深层次调控机制方面的研究还较少，加大此方面的研究将有助于全面认识miRNAs 在SSCs 增殖分化过程中的作用。

4 结 语

miRNAs 可通过与细胞因子、转录因子、蛋白受体等多种因素的相互表达调控，参与SSCs 自我更新和分化的调控过程。目前，大多数研究都聚焦于miRNAs 对SSCs 增殖与分化的直接调控作用，而其对生殖辅助细胞睾丸支持细胞、间质细胞等其他细胞中多种细胞因子的合成和分泌的调控机制还知之甚少。因此，后续加大miRNAs 对雄性生殖辅助细胞中细胞因子的合成和分泌的调控机制研究，将有利于更进一步揭示miRNAs 对SSCs 增殖与分化的作用机制。