影响冻融后小鼠精子受精能力的主要因素分析

刘腾飞，章延嘉，蒋惠炎，马雪云*

（1.华东师范大学生命医学研究所，上海 201100；2.华东师范大学计算机科学与软件工程学院，上海 201100）

随着CRISPR/cas9 技术的广泛应用，基因工程小鼠在科研、生产当中的使用也越来越普遍[1-4]，为了长期、稳定的保存这些珍贵基因修饰小鼠资源，将小鼠精子冷冻，然后在需要时重新复苏，重建该基因型的应用也随之增多[5-6]。以往研究表明，在小鼠资源重建过程中，相同密度和活力的小鼠精子，其体外受精率不尽相同，若仅以肉眼观察精子密度和活力，往往不能准确评估复苏精子的受精能力，从而难以预测体外受精率，造成实验资源、人力资源的浪费。Sohail 等[7]、Hirano 等[8]研究发现，水牛和人类的新鲜精子在体外受精时的结果不同程度受到直线速度（VSL）、平均路径速度（VAP）等影响。因此，对复苏后小鼠精子的质量进行全面测定，较为准确地推测精子的受精能力，对实际工作具有非常重要的意义。

SIRPA 是SIRP 家族中的一个典型的抑制免疫受体，其可以选择性表达于髓系细胞和神经细胞膜表面，而体内其他细胞则表达较少。对大量SIRPA 结构缺失小鼠的研究显示，SPRIA 没有表现出明显的发育障碍或者生长迟缓现象，该基因可参与细胞生长的调节，但对于生物体内胚胎发育或是胚后发育并不起关键作用[9]。HTR6 是与精神分裂症、阿尔兹海默症有关，对该基因型小鼠模型的生殖无影响。根据对目前研究结果的追踪，均未发现以上2 种基因型对小鼠生殖发育的影响。本研究选取SIRPA 和HTR6 2 种基因型小鼠的冷冻精子，运用计算机辅助分析技术（CASA）准确捕捉复苏精子头部运动图像，对精子动力学参数进行采集和分析，找出影响复苏精子受精能力的主要因素，进而达到对小鼠品系进行快速重建的目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 小鼠精子来源 华东师范大学调控生物学重点实验室小鼠精子库：选取SIRPA、HTR6 2 个基因型的冷冻精子进行本实验，以上基因型背景品系均为C57BL/6小鼠。

1.1.2 供卵雌鼠 雌鼠为华东师范大学闵行校区实验动物中心[SCXK（沪）2016-0004]自行繁育，均为野生型C57BL/6 小鼠品系，年龄为3～4 周龄。

1.1.3 试剂与仪器 冻精复苏液和体外受精液（HTF）均为本实验室配制[10]。注射用孕马血清激素（PMSG）、注射用人绒毛膜促性腺激素（hCG）均为宁波第二激素厂生产。迈朗精子分析仪：购自南宁松景天伦生物科技有限公司，仪器型号为ML-16011826。

1.1.4 主要参数 精子分析仪所测主要参数及计算方法：在计算机分析过程中，所选各视野内的被检精子个数之和为精子总数；精子密度为精液中的单位体积内的精子个数；精子活率为活动精子数占总精子数的百分比；精子活力率为前向运动精子占总精子数的百分比；VSL（μm/s）是精子在受检时间范围内所走直线距离对时间的平均值；曲线速度（VCL，μm/s）是精子沿其实际运动曲线，所走路程对时间的平均值；VAP（μm/s）为精子沿其空间平均移动轨迹运动时，所走路程对时间的平均值；侧摆幅度（ALH，μm/s）是精子在运动过程中，实际轨迹相对其平均移动轨迹的偏离幅度。鞭打频率（BCF，鞭打次数/s）为精子曲线运动轨迹越过其平均路径轨迹的次数对时间的平均值；直线性（LIN）用于表明精子实际所走路线的曲折程度，计算方法为VSL/VCL；平均移动角度（MAD）为精子沿其曲线轨迹瞬间转折角度的绝对值之和对时间的平均值；前向性（STR）用于表明精子平均移动轨迹的曲折程度，计算方法为VSL/VAP。

1.2 实验方法 本实验选用同一批次的同基因型雄鼠各6 只，每只小鼠精子冻存10 支麦管，每次复苏使用1支麦管的精子。实验中，每只小鼠随机复苏5 支麦管，故每个基因型重复30 次，多次重复复苏从而保证主成份分析的准确性。

1.2.1 精子复苏 从液氮中取出麦管，在空气中摇动15～30 s，投入37℃水浴中完全溶解，30 s 后剪开麦管，将精子及冻存液吹入1 mL 精子复苏液中，2 500 r/min离心3 min，弃去上清，保留50 μL 液体，再将EP 管底部精子重新悬浮。

1.2.2 精子动力参数检测 将样品加入精子计数板，用精子分析仪分析精子相关参数，每个基因型精子测试3 次。

1.2.3 卵子的获得 取3～4 周龄雌鼠，腹腔注射PMSG 7.5 IU，48 h 后注射hCG 7.5 IU，14～16 h 后，颈椎脱臼处死，无菌取出输卵管，体视显微镜下找到膨大部，释放卵团，将卵团挑入100 μL 已预热的用矿物油覆盖的HTF 中，置于37℃，体积分数5% CO2培养箱中。

1.2.4 受精过程 精子复苏后取适量精液加入含有卵团的受精滴中，调整精子浓度为1×107～5×107个/mL，置于37℃，体积分数5% CO2培养箱中继续培养，完成受精过程。

1.3 计算受精率 精卵结合6 h 后，将受精滴中的卵子用 37℃的 HTF 溶液清洗干净，置于KSOM 培养液中进行培养，18 h 后，统计2 细胞胚胎数量与参与受精的卵的总量并计算受精率，结果如表1 所示。每个基因型重复30 次。受精率=2 细胞胚胎数量/参与受精的卵的总量。

表1 复苏精子体外受精胚胎发育情况 个

1.4 统计分析 利用SPSS 23.0 版软件对分组数据进行主成分分析，分别对各基因型的各因素数值进行KMO 检测和Bartlett 检验，其中KMO 检测中，当KMO 值＞0.7，表明数据具有较好的相关性，可以做因素分析，如果KMO 值＜0.5，则不适合做因素分析；Bartlett 检验中，sig 值的显著性表示是否需要拒绝变量相互独立的假设，即因素是否适合因素分析。结果表示为平均值±标准差。

2 结果

2.1 精子复苏后动力学参数及结果 由表2 可知，基因型SIRPA 和基因型HTR6 的体外受精率分别为51.97%和70.08%。

2.2 KMO 检测和Bartlett 检验 分别对表2 中基因型的各因素数值进行KMO 检测和Bartlett 检验，得出基因型SIRPA 的KMO 值为0.778（＞0.7），Bartlett 检验结果P值（0.000）＜0.01，基因型HTR6 的KMO 值为0.771（＞0.7），Bartlett 检验结果P值（0.000）＜ 0.01，表明以上2 种基因型所测数据均适合做相关性分析。

2.3 碎石图确定影响体外受精率精子主要动力因素个数碎石图可粗略估计有几个因素对受精率具有相关性。由图1 可知，随着因素序号的增大，特征根迅速降低，VCL、VAP、ALH、BCF、LIN、MAD、STR 的特征根基本没有变化且趋于水平直线，由此可以基本认定2 种基因型均有4 个因素与受精率有较强相关性，但碎石图不能确定具体是哪4 个因素，需要进一步分析。

表2 精子复苏后动力参数及受精率

图1 基因型SIRPA（A）和基因型HTR6（B）碎石图

2.4 散点图确定影响体外受精率精子的主要动力因素将表2 中各基因型的精子参数绘制散点图，R2值结果如表3，R2值越大，说明该因素对受精率影响越紧密，选取其中4 个较大值因素，分别为VSL、VCL、VAP和ALH。

表3 精子复苏后各参数散点图R2值

2.5 卡方估值比较主要动力学因素 由散点图分析确定VCL、VAP、VSL 和ALH 是对复苏后精子受精率影响的4 个主要因素，利用卡方估值进行分析，基因型SIRPA 中VCL、VSL、ALH、VAP 的P 值分别为0.049、0.047、0.049、0.049，基 因 型HTR6 中VCL、VSL、ALH、VAP 的P值分别为0.028、0.021、0.028、0.028。由以上结果分析，2 个基因型各自VSL 的P值均最小，说明该因素对受精率的影响较大。因此判断，VSL 与受精率有更强的相关性，VCL、VAP 和ALH 对受精率的影响相同，对受精率的影响相对较小。

3 讨 论

CASA 是近几十年出现的分析技术，与人工评估技术相比，具有更快捷、更准确的特点，目前已较广泛地应用于科研及生产领域。本实验以2 种基因型C57BL/6小鼠冷冻精子为研究对象，精子复苏后，于受精前，利用CASA 进行了精子动力学分析，检测出精子的11 个动力学参数。2 种基因型精子的KMO 值均大于0.7，Bartlett 检验值为0.000，表明2 种基因型精子所测数据均与其受精率有较好的相关性，可以进行进一步分析。碎石图显示，11 个因素中，2 个基因型精子均有4 个因素与受精率存在较强的相关性，随后分析出VSL、VAP、VCL 和ALH 这4 个因素对精子受精率影响较大，其中VSL 影响最大，VCL、VAP 和ALH 相对较弱。

Sohail 等[7]研究显示，测试水牛精子的VCL、VSL、VAP 可以预测受精率，而BCF 与受精率关系不大。Hirano 等[8]研究显示，在人类不育症的IVF-ET 治疗中评估新鲜精子的VSL、ALH、VCL 和STR，可以在一定程度上对受精进行预测。另有研究显示，人类体外受精中卵裂率高组VCL、VAP 明显高于卵裂率低组[11]。胡庭溪等[12]通过分析3 头公牛精子的相关参数发现VAP、VCL、ALH 分别与其IVF 受精率、胚胎的卵裂率具有显著的相关性。同样，Ben 等[13]也认为以上参数与精子受精能力相关，有促进精卵结合的作用。精子的运动能力强可保证其准确到达受精部位以穿透卵丘细胞及透明带[14]。以上结果与本实验结果相似。结合本研究中所得数据，综合人类及牛的精子受精动力学因素分析结果，可以初步认为不同物种的精子在受精时所受精子自身因素影响相似。本实验中基因型SIRPA 受精率为51.97%，而基因型HTR6 受精率为70.08%，2 种基因型精子受精率相差较大，排除试验条件及人员的影响，推测基因型不同，精子的受精率也会不同，即基因型对转基因小鼠精子体外受精率有影响。有研究表明，在体外受精液中添加ATP、GSH 可提高受精率，这可能与增加能量物质和还原性物质可以提高精子的VSL、VAP、VCL 和ALH 有关，至于为何VSL 对受精率影响最大，及如何通过提高VSL 来提高受精率，需要进行更深入的研究。