海藻异枝麒麟菜多糖对纳米羟磷灰石晶体损伤小鼠血管平滑肌细胞的影响

韩 锦 姚智会 马晓桃 桂保松

1.西安交通大学第二附属医院肾病内科，陕西西安 710004；2.西安交通大学第二附属医院心血管内科，陕西西安 710004

心血管疾病是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者首要死亡原因，其中血管钙化（vascular calcification，VC）是心血管疾病的重要独立危险因素［1-5］。CKD 患者钙磷代谢紊乱导致血管平滑肌中羟基磷灰石（HAP）的形成，是VC 的关键启动和进展因素［6-7］。本课题组以往研究［8］纳米羟基磷灰石（nano-HAP）晶体可诱导小鼠血管平滑肌细胞（MOVAS）的细胞凋亡和坏死，加速VC 的发生。海藻异枝麒麟菜多糖（ESP）是一种以1,3-β-D-半乳吡喃糖和1,4-α-D-半乳吡喃糖作为基本骨架的直链硫酸酯多糖［9］，在医疗领域中应用广泛。已有研究报道了海藻多糖在抗癌、免疫调节、抑制平滑肌细胞增生等方面的应用［10-13］。然而，目前尚没有将ESP 用于预防和治疗VC 方面的报道。本研究拟探讨ESP 对nano-HAP 损伤的血管平滑肌细胞的保护作用，为研究ESP 防治CKD 的VC 治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

试剂：nano-HAP（纯度≥97%，粒径＜100 nm，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CCK-8 试剂（日本同仁化学研究所，批号：20180730-1）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：20190831）；苏木精（上海碧云天生物技术有限公司，批号：20150623）；ESP 由暨南大学生物矿化与结石病防治研究所欧阳建明教授赠予；MOVAS（广州吉妮欧生物科技有限公司）。

仪器：CO2细胞培养箱（Thermo，311，美国）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝，JY92-IIN）；酶标仪（Thermo MultiskanMK3，美国）；显微镜下观察（OLYMPUS，CKX41，日本）；多功能酶标仪（molecular devices，spectra-MaxM5，美国）；离心机（Thermo，Labofuge300，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 4 代MOVAS 用含10%胎牛血清的DMEM 培养液在37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 CCK-8 检测细胞活力 实验分为3 组：空白对照组：加入无血清培养液；模型组（nano-HAP 晶体处理组）：加入含有200 μg/mL nano-HAP 晶体的无血清培养液；实验组（多糖处理组）：在含有200 μg/mL nano-HAP 晶体的无血清培养基中分别加入浓度为50、150、450 μg/mL 的ESP。分为低浓度（50 μg/mL）、中浓度（150 μg/mL）、高浓度（450 μg/mL）3 组。每个浓度设3 个复孔。5.0×104个/mL MOVAS 细胞悬液每孔100 μL/孔接种于96 孔细胞培养板中培养24 h 后，弃掉培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1 次。空白对照组换为无血清培养液，模型组和实验组换为含nano-HAP 的无血清培养液。在培养2 h 后，实验组加入不同浓度的ESP。继续培养24 h 后用MTT 法测量各组细胞的活力，每孔加10 μL 的CCK-8 试剂，避光孵育1.5 h。用酶标仪在450 nm 处测量吸光度（A），求得3 个复孔A 值的平均值。

1.2.3 细胞LDH 释放量检测 实验分组参照“1.2.2”进行。增设最大酶活性组，每个浓度设3 个复孔。5.0×104个/mL MOVAS 细胞悬液每孔200 μL/孔接种于48 孔细胞培养板中培养24 h 后，弃掉培养液，PBS 清洗1 次。空白对照组和最大酶活性组换为无血清培养液，模型组和实验组换为含nano-HAP 的无血清培养液。在培养2 h 后，实验组加入不同浓度的ESP。继续培养24 h 后，各组均按LDH 试剂盒测试方法用酶标仪测定OD 值，求得3 个复孔A 值的平均值。LDH 释放率（%）=（处理样品吸光度-样品对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度）×100%。

1.2.4 苏木精-伊红（HE）染色观察细胞形貌 实验分组参照1.2.2 进行，MOVAS 细胞按浓度为1.5×105个/mL接种于12 孔培养板。把种好细胞的爬片用PBS 清洗2 次，用4%的多聚甲醛于室温固定15 min，再用PBS清洗3 次，用苏木精染色15 min，用水冲洗3 次，换用新鲜的蒸馏水再洗涤2 min，用伊红染色液染色5 min，用水冲洗3 次，换用新鲜的蒸馏水再洗涤2 min，显微镜下观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示。比较采用单因素方差分析和t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESP 对nano-HAP 诱导的MOVAS 活力的影响

Nano-HAP 处理MOVAS 以及不同浓度多糖干预之后，各组细胞活力如图1A 所示，空白对照组细胞活力设为100%。与空白对照组比较，模型组的细胞活力减少至（42.5±8.9）%，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。

加入不同浓度（50、150、450 μg/mL）的ESP 进行保护后，细胞活力升高到（51.3±5.8）%、（59.2±7.6）%、（72.1±9.8）%，与模型组比较，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01），低浓度组与中、高浓度组比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），中浓度组与高浓度组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.2 ESP 降低nano-HAP 诱导损伤细胞的LDH 释放率

将最大酶活性组LDH 释放率设为100%，各组细胞的LDH 释放率如图1B 所示，空白对照组释放率为（18.1±4.8）%，而模型组为（52.2±5.1）%，比较差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。随着ESP 浓度从50 μg/mL升高到450 μg/mL，LDH 释放量依次降低至（41.2±4.9）%、（35.8±5.8）%和（31.8±5.0）%，低浓度组与中、高浓度组比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），中浓度组与高浓度组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.3 HE 染色观察细胞形貌

采用HE 染料对细胞进行染色可以观察细胞的形态变化。空白对照组细胞形态光滑饱满，呈长梭形，见图2a（封四）。而模型组细胞体积缩小，胞质致密，见图2b（封四），并且细胞数量减少。实验组在加入不同浓度的多糖进行保护后，实验组细胞形貌处在对照组与模型组之间，见图2c～e（封四）。

图1 ESP 对nano-HAP 诱导损伤MOVAS 细胞活力和LDH 释放量的影响

3 讨论

VC 是慢性肾脏病患者的常见并发症。VC 是一个包含平滑肌细胞向成骨样细胞表型转换的类似骨形成的生理过程［14-15］。纳米级磷酸钙晶体能够通过诱导人主动脉血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转换来诱导细胞钙化，并且细胞钙化程度与磷酸钙晶体作用时间呈正相关［16-17］。在培养基中添加HAP 引起血管平滑肌损伤过程与体内HAP 诱导细胞损伤的过程类似。因此，本研究采用nano-HAP 晶体诱导MOVAS 损伤的模型，观察了ESP 对血管平滑肌的保护作用。

本研究首先通过MTT 法检测不同浓度ESP 对nano-HAP 晶体损伤的MOVAS 活力的影响，结果表明ESP 能够抑制nano-HAP 晶体导致的MOVAS 损伤，且在50～450 μmol/L 呈明显的浓度依赖性。多糖对细胞的修复或者保护所用的浓度范围很广。Li 等［18］研究显示浓度为50、100、150、200、250、300 μg/mL 的Morchella esculenta 多糖抑制了H2O2引起的A549 细胞的凋亡与氧化应激；Liang 等［19］也发现在浓度范围为5～1000 μg/mL 的红藻多糖对HUVEC 无毒性并且刺激细胞的增殖，当浓度为800 μg/mL 时，细胞的活力达到了140%。因此本研究选择了50、150、450 μg/mL。

LDH 是细胞浆内酶，当细胞损伤调亡而造成的细胞膜通透性发生改变时，胞内的LDH 会透过细胞膜释放到细胞外，因此LDH 的检测可作为评价细胞膜破坏程度的重要指标［20］。本研究通过检测从细胞释放到培养液中的LDH 的含量，定量分析了加入nano-HAP 对细胞膜的损伤程度，发现nano-HAP 晶体可破坏MOVAS 细胞的细胞膜，导致LDH 释放增加。而加入不同浓度的ESP 多糖后能明显减少LDH 的释放量。提示ESP 对MOVAS 细胞有保护作用，且在450 μg/mL 浓度内，随着ESP 浓度增加，保护效果增强。

本研究采用HE 染料对细胞进行染色观察细胞的形态变化。结果发现，经过nano-HAP 损伤后的细胞体积缩小，细胞质浓缩，而加入不同浓度的多糖进行保护后，实验组细胞形貌处在空白对照组与模型组之间，且ESP 浓度越高，保护作用越强。

综上所述，本研究采用nano-HAP 晶体诱导MOVAS损伤的模型，观察了ESP 对血管平滑肌的保护作用。结果显示，ESP 通过抑制HAP 诱导的血管平滑肌细胞活力下降、LDH 释放率增高，从而发挥其对血管平滑肌细胞的保护作用。因缺乏体内实验的验证，本研究的结果具有一定的局限性，但是为研究ESP 抗血管钙化的机制提供了一定的理论基础。