过表达E3泛素连接酶CHIP对脑胶质瘤细胞U251周期及凋亡的影响

陈洪福 张 慧 梅鹏金 聂 耳

徐州医科大学附属医院神经外科，江苏 徐州 221004

神经胶质瘤是目前已知发病率最高的原发性颅内肿瘤，常规手术后，胶质母细胞瘤患者补充放疗和化疗。虽然诊断和治疗策略正在取得进展，但在大多数情况下，中位生存时间不到1 a。胶质瘤患者的5 a生存率是所有癌症中最低的[1-2]。然而，脑胶瘤发生、发展的生物学和分子机制尚不清楚，需要进一步探索为胶质瘤的治疗提供新的治疗靶点[3]。CHIP (Hsc70羧基末端相互作用蛋白)是U-box E3泛素连接酶。最近，发现U-box E3酶CHIP可促进或抑制胶质瘤的生长[4-5]。迄今为止，CHIP在脑胶质瘤中的确切功能和潜在机制尚不清楚。本实验应用过表达CHIP质粒，研究其对脑胶质瘤细胞U251系周期和凋亡的影响，探索其在胶质瘤中的确切功能。

1 材料与方法

1．1材料脑胶质瘤细胞系U251在实验室冻存，pcDNA3.1空载质粒、pcDNA3.1-CHIP质粒由江苏省肿瘤生物治疗重点实验室惠赠，使用的是Thermo集团提供的DMEM营养液，四季青集团提供的胎牛血清，碧云天集团提供的含量为0.25%胰酶溶液，Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen公司)，细胞周期检测试剂盒(南京凯基公司)，细胞凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术公司)，CHIP一抗(Santa Cruz公司)，β-action一抗(Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG(北京中杉公司)。

1．2细胞培养及分组脑胶质瘤细胞系U251在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中于37 ℃、5% CO2孵箱培养，并用0.25%胰蛋白酶(2～3 d)传代。本实验的所有指标测试如下：CHIP OE组(转染pcDNA3.1-CHIP质粒)、CHIP Ctrl组(转染pcDNA3.1空载质粒)。

1．3质粒转染U251细胞分别转染CHIP OE、CHIP Ctrl质粒(60 mm小皿)在其生长约90%融合时，并严格依据Lipofectamine 2000中的操作指南来做，然后针对实验样本做分类。

1．4Westernblot实验主要是针对CHIP蛋白进行操作，需要将其先进行转染处理48 h然后取出，并将其所产生的细胞汇总，加入RIPA裂解液里，确保其温度控制在4 ℃，以每分钟15 000 g的速度做离心处理15 min，将其溶液中的清液用滴管提取出来，设定其是实验的总蛋白；然后需要5个蛋白缓冲液，放置在100 ℃的纯净水中5 min使其性状发生改变；用含量为10%的SDS-PAGE溶液进行分离处理，并将其放置在NC膜表面进行观察；配置比例为1：500的免抗人CHIP跟β-actin抗体溶液，将其温度控制在4 ℃，然后静置一夜；用洗涤缓冲液进行反复冲洗，5 min/次，需要冲洗3次，然后添加溶度为0.1%的二抗，放置在常温的环境下2 h；做BCIP /NBT显色对比实验。然后通过image J程序对其不同灰度值的CHIP蛋白的情况进行分析。

1．5流式细胞仪检测脑胶质瘤细胞U251细胞周期变化0.25%胰酶消化CHIP OE、CHIP Ctrl质粒转染U251细胞，然后将其以每分钟2 000转的速度进行离心处理5 min。再将其含量调整到1×106/mL留作备用；然后在4℃下，用70%乙醇固定过夜；第2天，通过离心收集细胞，用预先冷却的PBS洗涤细胞2遍，小心吸出上清并保留，可以残留50 μL左右的PBS，以避免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团；加100 μL RNase A 溶液，放置在37℃的水中半小时；然后需要添加400 μL的PI溶液进行染色处理并将其搅拌均匀，在无光照的环境下，将其温度控制在4 ℃静置半小时；然后流式细胞仪检测。

1．6流式细胞仪检测脑胶质瘤细胞U251细胞凋亡变化0.25%胰酶消化CHIP OE、CHIP Ctrl质粒转染U251细胞，离心收集细胞，细胞计数后，取 5×105～1×106个细胞，1 000 r/min，在4 ℃下，离心10 min，弃去上清；加入1 mL预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；1 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，重复2次；将细胞重悬于200 μL结合缓冲液上；添加10 μL的膜联蛋白V-FITC溶液摇匀，在常温的环境下遮光处理15 min；添加300 μL的结合缓冲液和5 μL PI，然后使用流式设备对其进行测试。

2 结果

2．1Westernblot分析CHIP蛋白的表达情况测定2组蛋白条带(图1)的灰度值。结果显示：CHIP Ctrl组的CHIP蛋白表达(0.089±0.012)较CHIP OE组(0.912±0.013)低，差异有统计学意义(P<0.001)，表明成功转染CHIP OE质粒，可显著提高CHIP/STUB1基因的表达水平。

2．2流式细胞仪检测脑胶质瘤细胞U251周期变化结果CHIP OE质粒显著改变脑胶质瘤细胞U251细胞周期，G0/G1期所占比例增加，S、G2/M期所占比例减少，与CHIP Ctrl 组相比，差异有统计学意义(表1)。CHIP OE组、CHIP Ctrl 组，G0/G1、S、G2/M各期所占比例统计见图2。

表1过表达CHIP对脑胶质瘤细胞U251周期的影响

Table1EffectofoverexpressionofCHIPonU251cycleofgliomacells

注：与对照组(CHIP Ctrl)相比，*P<0.001，**P<0.01，***P<0.05

注：与对照组(CHIP Ctrl)相比，*P<0.001，**P<0.01，***P<0.05图2 过表达CHIP对脑胶质瘤细胞U251周期的影响统计图Figure 2 Statistical analysis of the effect of overexpression of CHIP on glioma cell U251 cycle

2．3流式细胞仪检测脑胶质瘤细胞U251凋亡变化结果CHIP Ctrl组脑胶质瘤细胞凋亡率(12.13 ±0.87)%，CHIP OE组脑胶质瘤细胞凋亡率(22.83±1.38)%，过表达CHIP增加脑胶质瘤细胞U251凋亡率(图3右上、右下象限为凋亡细胞)，与CHIP Ctrl 组相比，差异有统计学意义(P<0.001)。见图3、4。

图3 过表达CHIP对脑胶质瘤细胞U251凋亡的影响Figure 3 Effect of overexpression of CHIP on apoptosis of glioma cell line U251

注：与对照组(CHIP Ctrl)相比，*P<0.001图4 过表达CHIP对脑胶质瘤细胞U251凋亡的影响统计图Figure 4 Effect of overexpression of CHIP on apoptosis of glioma cell line U251

3 讨论

脑胶质细胞瘤作为神经外科疾病中常见的恶性肿瘤，尽管有手术、放疗及化疗等综合治疗方法，但临床效果并不满意，其仍然以生存率低、预后差、易复发被认为是神经外科的难题之一。胶质瘤相关肿瘤蛋白的研究将为胶质瘤的治疗，提供新的治疗靶点。CHIP是BALLINGER等[6]在用亲环素40(CyP40)包含TPR(tetratricopeptide repeat)中的某些片段信息的蛋白质，这种新型的蛋白质，由于可以和Carboxyl end of heat shock protein反应称之为CHIP，其分子量约35 kD。研究发现，上皮-间质转化(EMT)在早期肿瘤转化为侵袭性恶性肿瘤中起关键作用。转录因子Snail是一种极不稳定的蛋白质，其亚细胞水平受许多E3泛素连接酶调节，促进EMT以及相关的病理特征，包括迁移、侵袭和转移。Hsc70相互作用蛋白(CHIP)的羧基末端作为一种新型Snail泛素连接酶，其与Snail相互作用以诱导泛素介导的蛋白酶体降解。抑制CHIP表达增加Snail蛋白水平，诱导EMT并增强体外迁移和侵袭以及卵巢癌细胞的体内转移[7]。SHANG等发现U-box E3连接酶通过抑制有氧糖酵解抑制卵巢癌的肿瘤进展。CHIP的诱导表达导致体外和体内实验中肿瘤生长的显着抑制。相反，CHIP的消耗导致肿瘤生长的促进。CHIP的消耗或敲除增加了肿瘤和小鼠胚胎成纤维细胞中的糖酵解产物。同时，其发现CHIP表达与人卵巢癌中的PKM2水平呈负相关[8]。此研究结果与我们前期在脑胶质瘤生物学行为的报告结果差不多。

根据实验结果显示，CHIP可促进癌细胞的生长，也可以抑制癌细胞的生长。PAUL等[5]研究发现CHIP与c-Myc相互作用并泛素化，从而将其靶向蛋白酶体介导的降解。过表达CHIP可加速c-Myc蛋白的转换率。相反，通过RNAi敲除CHIP可稳定内源性c-Myc。CHIP跟c-Myc两者的关系跟分子伴侣有关。并且由于c-Myc细胞的活性，可以在一定程度上降低癌细胞的活性。研究[4]认为，CHIP的增加与胶质瘤分级高相关，伴随着高级神经胶质瘤中Ki-67表达的增加。在正常脑中，CHIP主要在神经元的细胞质中表达。调节CHIP水平可能是胶质瘤肿瘤发生的关键决定因素。 CHIP的过表达可以增强体外U251和U87胶质瘤细胞系的增殖和集落形成，而CHIP RNAi可以获得相反的结果。此外，在肿瘤内注射含有CHIP shRNA的慢病毒后，异种移植物中的肿瘤生长显着减慢，而在瘤内注射CHIP过表达的慢病毒后检测到肿瘤生长的增强。这些结果表明CHIP是体外和体内肿瘤发生所必需的，并可以诱导人脑胶质瘤的肿瘤发生，发现CHIP调节胶质瘤细胞的变化是可以利用存活素来进行观察的。

由于现阶段针对CHIP的研究并不完善，没有针对不同的肿瘤进行实验，因此其致癌和抑癌情况还需要做更深一步的研究[9-40]。

根据本课题实验的内容表明，由于pcDNA3.1-CHIP可以对U251细胞进行染色，所以其具有一定的有效表达，然后通过蛋白质印迹实验，查看其CHIP蛋白形成融合蛋白并且较对照组表达量明显增加。流式细胞仪检测细胞周期结果示，CHIP过表达质粒阻碍脑胶质瘤细胞U251 G0/G1期进展，出现G0/G1期停滞现象，其机制可能与CHIP过表达减少Snail蛋白水平，导致泛素介导的蛋白酶体降解减少，抑制EMT从而出现细胞周期停滞现象有关[7]，其具体机制仍需进一步实验探索。流式细胞仪检测细胞凋亡，WinMDI软件分析数据结果示，CHIP过表达质粒促进脑胶质瘤细胞U251凋亡，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.001)；本课题的内容跟Paul的报告内容差不多，亦或过表达E3连接酶通过抑制有氧糖酵解，从而促进凋亡，因CHIP有两个主要功能结构域，TPR结构域和U-box结构域[6，8]，这是其功能复杂性所在，本实验结果中，CHIP在治疗脑胶质瘤的过程中，其产生的效果非常明显，可以作为后续临床医疗的依据作为参考，并为该领域的靶向治疗方案提供一定的价值。