集束化疗法对C PR兔心脏保护机制的实验研究

刘凤艳 ，张 欣 *，梁建庆 ，胡 蓉 ，杜雪洋 ，王 鑫

（1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州730000）

本研究观察心搏骤停（CA）模型兔心肺复苏（CPR）后血流动力学指标、脑钠肽（BNP）、氧化应激指标、cTnI、CK、CK-MB、LDH的变化，为CA后的治疗提供新方法。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

肝素（天津生化制药有限公司，6.25 kU/ml，批号：H18030914）；盐酸肾上腺素（上海禾丰制药有限公司，1 mg/ml，批号：181108）；黄芪注射液（正大青春宝药业有限公司，每支10 ml，相当于原药材20 g，批号：1812062）；戊巴比妥钠（上海中西药业股份有限公司，批号：WS20180920）；氨基甲酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180125）。

兔BNP（批号：H166）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒，丙二醛（MDA，批号：A003-1）测定试剂盒，谷胱甘肽（GSH，批号：A006-2）测定试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号：A005）测定试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD，批号：A001-3）检测试剂盒，CK（批号：A032）测定试剂盒，CK-MB（批号：E006）测定试剂盒，LDH（批号：A020-2）测定试剂盒，cTnI（批号：E019）测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验仪器

DHX-300动物呼吸机、RM6240BD型多道生理信号采集处理系统、YP100型压力传感器、YPJ01型压力换能器（均为成都仪器厂生产）；聚乙烯医用塑料心脏导管、动脉导管（成都泰盟科技有限公司，外径2.0 mm，内径1.5 mm）；T型套管；家兔实验台；常用实验器械；肛温表；联想微型计算机；健源注射泵（JZB-1800）；高速冷冻离心机（Multifuge IS-R，德国 THERMO公司）；Biotek Synergy2多功能酶标仪（美国基因有限公司生产）；电热恒温水浴箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.3 实验动物分组及模型制备[1]

选择24只日本大耳白兔，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，动物合格证号：SYXK（甘）2015-0003。采用随机数字表法将白兔分为假手术组、肾上腺素组、亚低温组及集束化治疗组，每组6只。耳缘静脉注射25%乌拉坦4 ml/kg麻醉动物（必要时可追加），无菌操作下分离气管，切开气管插入T型套管，分离左颈总动脉、左股动脉与右颈静脉。经左颈总动脉插入心脏导管至左心室，连接RM6240BD型多道生理信号采集处理系统监测左心室血流动力学指标；左股动脉插入动脉导管，连接生理信号采集处理系统监测平均动脉压（MAP）。体外电击诱发心室纤颤（室颤）动物模型，50 V交流电持续放电30 s，监护仪显示出现室颤波及MAP＜20 mmHg持续3 min表示动物模型制备成功。

集束化治疗组术后立即开始CPR、胸外按压（按压频率200次/min，按压深度为兔胸廓前后径的1/3）与机械通气（吸入氧气浓度为1 L/min，通气频率45次/分钟，潮气量15 ml/kg），并经右颈静脉泵入肾上腺素30 μg/kg和黄芪注射液4 g/kg。复苏2 min后若仍为室颤则给予30 J单相波电除颤，之后持续胸外按压2 min，如仍为室颤再以同样能量电除颤，如此反复3次为一个周期。15 min后自主循环仍未恢复视为复苏失败。若出现室上性自主心律、MAP≥60 mmHg并持续5 min则表示自主循环恢复（ROSC），复苏成功。ROSC后快速诱导亚低温并维持至实验结束。

假手术组不进行体外电击致颤，不静脉给药，不实施亚低温疗法。肾上腺素组仅给予肾上腺素复苏。亚低温组除不给予黄芪注射液外，其余处理同集束化治疗组。所有操作按照Utstein动物模型复苏指南[2]进行。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.4 亚低温疗法

用输液泵从白兔耳缘静脉以1.0 ml/kg·min速度泵入4℃的0.9%氯化钠注射液，同时配合体表降温（将碎冰置于中空手术台内，冰量按体质量给予100 g/100 mg）[3]。10～15 min内白兔肛温降至目标温度（32℃～34℃），达到目标温度后停止泵入4℃的0.9%氯化钠注射液，继续体表降温维持目标温度。亚低温诱导过程中若白兔出现寒战，可解除体表降温，待寒战反应逐渐消失后，依据监测温度调节体表降温冰量，确保模型组白兔体温波动在目标范围内。

1.5 检测指标

复苏后观察4 h，记录一般情况，腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死白兔。

1.5.1 左室舒张期末压（LVEDP）、左室内压上升/下降最大速率（±dp/dt max）及MAP 于致颤前15 min和复苏后30、60、120、180、240 min使用RM6240BD型多道生理信号采集处理系统测定LVEDP、±dp/dt max及MAP。

1.5.2 BNP[4]分别于致颤前15 min和复苏后30、180、240 min采集动脉血1.5 ml，离心10 min分离血清，储存于-20℃待测。采用ELISA检测BNP水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.3 氧化应激指标[5]复苏后观察4 h，处死白兔，摘取心肌组织，取适量上清液进行丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）检测，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.4 cTnI、CK、CK-MB、LDH 指标[6]复苏后观察 4 h，处死白兔，立即采集右颈静脉血 5 ml，测定 cTnI、CK、CK-MB、LDH，采用ELISA法检测。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 术前情况

24只白兔全部诱发CA，成功复苏并观察240 min。4组动物的基本生理参数、体质量、麻醉药物用量、手术时程等比较均无明显差异，具有可比性。

2.2 4组CPR前后血流动力学指标变化（见表1）

致颤前4组血流动力学指标差异均无显著性（P＞0.05）。复苏后各时间点肾上腺素组、亚低温组及集束化治疗组LVEDP均较假手术组明显升高；集束化治疗组复苏后各时间点LVEDP明显低于肾上腺素组和亚低温组（均P＜0.01）；肾上腺素组、亚低温组和集束化治疗组复苏后各时间点±dp/dt max及MAP均低于假手术组；集束化治疗组复苏后各时间点±dp/dt max及MAP明显高于肾上腺素组和亚低温组（均P＜0.01）。

2.3 4组CPR前后BNP变化（见表1）

致颤前，4组BNP比较差异无显著性（P＞0.05）；复苏后各时间点肾上腺素组、亚低温组和集束化治疗组BNP高于假手术组，集束化治疗组复苏后各时间点BNP明显低于肾上腺素组和亚低温组（均P＜0.01）。

表1 4组心肺复苏前后血流动力学指标变化（±s）

表1 4组心肺复苏前后血流动力学指标变化（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与同期肾上腺素组比较，bP＜0.01；与同期亚低温组比较，cP＜0.01

组别时间（m i n）+d p/d t m a x（m m H g/m s）-d p/d t m a x（m m H g/m s）M A P（m m H g）B N P（n g/L）假手术组7 7 7 3±2 8 8 5 9 5 3±2 1 1致颤前1 5复苏后3 0复苏后6 0复苏后1 2 0复苏后1 8 0复苏后2 4 0致颤前1 5复苏后3 0复苏后6 0复苏后1 2 0复苏后1 8 0复苏后2 4 0致颤前1 5复苏后3 0复苏后6 0复苏后1 2 0复苏后1 8 0复苏后2 4 0致颤前1 5复苏后3 0复苏后6 0复苏后1 2 0复苏后1 8 0复苏后2 4 0 L V E D P（m m H g）2.4 2±0.2 2 2.4 4±0.2 3 2.6 4±0.1 5 2.6 8±0.1 5 2.7 0±0.1 4 2.8 0±0.1 6 2.3 9±0.2 3 8.0 0±0.1 8 a 8.8 9±0.1 4 a 7 7 1 8±3 7 5 5 5 6 3±1 8 7 1 4 2±1 3 1 4 5±1 4 7 6 8 7±3 8 6 5 4 7 6±1 9 1 7 6 5 7±3 8 1 5 0 6 5±1 9 4--7 5 3 2±3 2 1 4 7 7 3±1 8 0 6 5 3 5±3 2 2 3 9 7 2±1 7 6肾上腺素组7 6 4 6±3 1 3 5 8 8 1±1 8 5 3 7 6 5±3 0 3 a 2 4 0 5±1 9 8 a 1 4 1±2 0 1 4 8±1 5 1 3 7±1 9 3 4 2±1 5 a 3 5 6 3±1 8 0 a 2 3 8 1±2 5 6 a 1 0.0 2±0.2 1 a 1 1.5 0±0.3 7 a 1 2.4 7±0.3 3 a 2.4 6±0.2 3 5.8 7±0.2 1 ab 6.7 9±0.2 0 ab 7.3 8±0.2 2 ab 8.5 7±0.1 9 ab 9.4 4±0.2 3 ab 2.4 1±0.2 1 2.8 6±0.2 0 abc 3.7 8±0.1 9 abc 4.3 7±0.2 1 abc 5.5 8±0.1 8 abc 6.4 6±0.2 3 abc 2 3 5 6±2 3 4 a 1 9 8 3±3 3 4 a--2 2 7 9±2 0 0 a 1 7 1 2±2 0 1 a 2 0 4 5±3 1 0 a 1 4 1 5±1 8 7 a亚低温组7 7 5 9±1 7 0 5 6 9 9±2 0 0 5 1 8 8±1 9 3 ab 3 6 5 6±2 6 7 ab 2 9 1±1 5 a 2 8 4±1 4 a 1 4 5±1 3 3 0 3±2 4 ab 4 7 3 7±2 5 4 ab 3 5 7 4±3 5 7 ab 3 5 5 6±2 8 3 ab 3 3 8 9±1 9 1 ab--3 5 2 3±2 2 0 ab 2 7 1 8±2 0 3 ab 3 2 1 4±1 5 7 ab 2 4 5 7±2 4 5 ab集束化治疗组7 8 0 0±5 2 0 5 8 5 9±2 5 2 6 2 1 1±1 9 2 abc 5 1 0 4±3 6 8 abc 2 6 4±2 0 ab 2 5 0±2 5 ab 1 4 3±1 2 2 6 4±1 7 abc 5 7 4 7±2 0 4 abc 4 8 7 5±2 9 4 abc 4 8 7 5±1 8 1 abc 4 6 6 7±1 5 4 abc--4 5 7 5±2 2 4 abc 4 1 8 7±1 9 7 abc 4 2 1 9±3 5 2 abc 3 6 8 7±1 6 7 abc 9 6.9 1±1.9 8 9 3.2 1±2.0 5 9 2.0 6±1.8 8 9 0.1 1±1.9 9 8 8.1 0±2.8 3 8 7.1 0±2.8 0 9 5.8 4±2.5 5 5 0.1 6±1.7 8 a 4 8.3 3±1.2 6 a 4 7.5 5±0.9 9 a 4 3.6 0±2.7 8 a 4 4.1 3±1.0 7 a 9 4.6 2±2.8 1 6 3.3 4±2.1 2 ab 6 5.1 4±3.1 7 ab 6 5.2 1±2.6 1 ab 6 0.7 5±2.1 1 ab 5 6.7 7±1.6 0 ab 9 6.9 5±1.8 5 8 8.3 6±1.9 5 abc 8 7.0 3±1.8 3 abc 8 5.0 3±1.8 2 abc 8 3.1 8±1.8 0 abc 8 2.0 1±1.8 0 abc 2 2 6±1 5 abc 1 9 8±1 7 abc

2.4 4组CPR后氧化应激指标变化（见表2）

表2 4组心肺复苏后240 min氧化应激指标变化（±s）

表2 4组心肺复苏后240 min氧化应激指标变化（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与同期肾上腺素组比较，bP＜0.01；与同期亚低温组比较，cP＜0.01

组别 G S H（m g/g p r o t）M D A（n m o l/m g p r o t）G S H-P x（U/m g p r o t）S O D（U/m g p r o t）假手术组肾上腺素组亚低温组集束化治疗组4.2 2±0.2 7 8 8.6 0±3.5 0 2 9.1 1±0.3 8 a 1 6.9 9±0.4 1 ab 1 0.4 6±0.3 2 abc 1 4.6 5±0.4 2 1.0 2±0.3 6 a 2.9 9±0.3 8 ab 8.1 2±0.3 1 abc 2 0.3 1±3.5 6 a 3 9.6 9±3.5 8 ab 5 5.3 4±3.4 1 abc 3 7 4.2 7±6.5 6 6 8.9 4±5.0 4 a 2 2 1.3 2±4.3 2 ab 3 0 1.9 7±5.0 2 abc

复苏后肾上腺素组、亚低温组和集束化治疗组MDA高于假手术组，GSH、GSH-Px、SOD低于假手术组；集束化治疗组MDA明显低于肾上腺素组和亚低温组，GSH、GSH-Px、SOD明显高于于肾上腺素组和亚低温组（均P＜0.01）。

2.5 4组 CPR 后 cTnI、CK、CK-MB、LDH 比较（见表 3）

表3 4 组心肺复苏后 240 min cTnI、CK、CK-MB、LDH 比较（±s）

表3 4 组心肺复苏后 240 min cTnI、CK、CK-MB、LDH 比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与同期肾上腺素组比较，bP＜0.01；与同期亚低温组比较，cP＜0.01

组别 C K（U/L）c T n I（μ g/L）C K-M B（U/L）L D H（U/L）假手术组肾上腺素组亚低温组集束化治疗组4.0 2±0.2 7 1 9.0 1±0.3 8 a 1 6.2 9±0.4 1 ab 8.3 6±0.3 2 abc 7 4.6 5±3.4 2 2 9 7.0 2±3.3 6 a 2 0 8.9 9±3.3 8 ab 1 0 5.1 2±3.3 1 abc 1 8.6 0±4.5 0 5 0.3 1±3.5 6 a 3 9.6 9±3.5 8 ab 2 5.3 4±3.4 1 abc 1 7 4.2 7±7.5 6 3 6 8.9 4±5.0 4 a 3 0 1.3 2±4.3 2 ab 2 0 1.9 7±5.0 2 abc

复苏后肾上腺素组、亚低温组和集束化治疗组cTnI、CK、CK-MB、LDH 高于假手术组，集束化治疗组 cTnI、CK、CK-MB、LDH明显低于肾上腺素组和亚低温组（均P＜0.01）。

3 讨论

3.1 心脏骤停后综合征的本质是缺血再灌注损伤，临床无理想治疗方法

心脏骤停后综合征（PCAS）是指在心跳骤停后经过有效抢救，虽然恢复了自主循环（ROSC），但因全身缺血时间较长而造成多脏器损伤或在缺血再灌注时及再灌注之后出现脏器损伤，并导致的一系列病理生理学改变。PCAS的本质是缺血再灌注损伤，是临床最严重的并发症之一，可导致多数患者死亡或留下严重后遗症[7]。

3.2 心脏骤停后综合征西医治疗效果欠佳，中医疗效令人鼓舞

令人遗憾的是，目前西医对PCAS的治疗效果不容乐观，肾上腺素是最常用的药物。但肾上腺素在发挥缩血管作用、提高冠脉灌注压（CPP）、增加ROSC的同时也因增加耗氧量而无法改善远期预后[8]。院外患者ROSC后立即静脉输注冷液体治疗，及时转运到急诊科ICU应用亚低温技术（如血管内降温、经鼻冷却和体外包埋降温等技术），有望提高出院存活率[9]。因此，亚低温疗法值得进一步研究。有研究报道，用黄芪注射液给大鼠灌胃可明显改善慢性心衰大鼠心功能，升高±dp/dt max，降低LVEDP水平[10]。黄芪注射液腹腔注射，可改善心衰大鼠的血流动力学指标[11]。基于此，本研究采用黄芪注射液联合肾上腺素、亚低温等集束化治疗PCAS，以预防心肌缺血再灌注损伤。目前研究认为，氧化应激损伤也是PCAS脑损伤的重要机制之一[12-15]。心肌细胞内含有多种酶（cTnI、CK、CK-MB、LDH 等），参与各种生理活动。当心肌细胞发生损伤或细胞膜通透性升高时，心肌细胞内的酶会释放入血，因此，临床上常根据血清心肌酶的变化判断心肌损伤程度[16]。

3.3 集束化疗法对PCAS家兔心脏的保护机制

课题组前期研究发现，集束化疗法对PCAS家兔心脏有明显的保护作用，其机制可能与改善血流动力学有关[17]。在其疗效得到肯定的基础上，我们拟对其发挥作用的分子机制做进一步探讨。本研究结果显示，复苏后集束化治疗组各时间点LVEDP、BNP明显低于肾上腺素组、亚低温组，±dp/dt max、MAP明显高于肾上腺素组、亚低温组（均P＜0.01），MDA明显低于肾上腺素组、亚低温组，GSH、GSH-Px、SOD明显高于于肾上腺素组、亚低温组（均P＜0.01），cTnI、CK、CK-MB、LDH 明显低于肾上腺素组、亚低温组（均P＜0.01）。表明，集束化疗法可明显改善白兔心功能，优化血流动力学、BNP、氧化应激及心肌酶学指标，减轻缺血再灌注损伤，发挥器官保护作用，值得推广。