贵州油茶叶枯病病原鉴定研究

秦绍钊 王建伟 张柱亭

摘 要 拟盘多毛孢菌属真菌侵染的寄主种类多、范围广，可引起多种经济作物和观赏植物的多类病害，病征具有多样性。在前期对贵州省油茶叶枯病的研究过程中，分离到一个拟盘多毛孢菌的新致病菌KLXY-7-2。通过病原菌的分离与纯化、形态学鉴定和微管蛋白基因（TUB2）构建系统发育树等多种检测方法，KLXY-7-2菌鉴定结果为木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。病原菌与拟盘多毛孢属EF055226.1、EF055231.1真菌聚为一个独立的进化分支，且置信度为99%。本研究所鉴定的油茶木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi），在油茶叶枯病的相关研究属于首次报道，可为进一步明确该病原菌的发生规律及预防时期提供科学依据。

关键词 叶枯病;拟盘多毛孢;形态学;新种;分子鉴定

中图分类号：S794.4 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.26.067

油茶（Camellia oleifera）作为木本油料作物，在贵州省栽培历史悠久，是发展农业农村经济的重要支撑力量。拟盘多毛孢属真菌是多种经济作物和观赏植物病害的重要致病菌，感病后的典型病状为叶枯，感病叶片坏死面积达整片叶1/2以上。国内报道的拟盘多毛属真菌侵染油茶的菌种主要有茶拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis theae）和小孢拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）[1-2]。

近年来，拟盘多毛孢菌的鉴定方法逐渐完善和规范，依据生物学、柯赫氏法则、系统发育学等特征鉴定种类，结果较准确和可信，逐渐解决了种类鉴定上易混淆的问题。本研究所鉴定的油茶木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）在贵州油茶病害研究中未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

2016—2018年采集油茶叶枯病叶片标本于凯里市、黎平县、天柱县、锦屏县及黄平县，分别集中于在6—8月，10—11月采集病样，从病叶的病健交接处经组织分离，用PDA培养3～5 d后，4 ℃冰箱内保存备用。叶枯病病斑呈不规则状，红褐色至灰褐色，连片成大枯斑（如图1）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化

常规组织分离法：先用75%的酒精处理病健交界的组织，0.1%升汞溶液消毒，无菌水漂洗干净，PDA培养基纯化培养，置于4 ℃下保存备用。

1.2.2 病原菌的形态鉴定

取5 mm菌饼在PDA平板26～28 ℃黑暗16 h培养，2～5 d连续观察菌落的形态、颜色，并取10 μL孢子悬浮液在光学显微镜下观察记录其大小及形态特征。

1.2.3 分子鉴定与系统发育分析

取50 mg菌丝经液氮研磨，样品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒，Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒SK8259。引物如下：Bt2a 5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3，Bt2b 5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3。

将测序的rDNA-TUB2与GenBank中相关菌株序列利用ClustalX 1.83软件进行比对分析。在基因系统发育分析结果中选出与各分离菌株相似度较高的相应序列，将所选序列与GenBank中拟盘多毛孢菌的基因序列采用MEGA 7.0.14软件中的最大简约法（MP）做聚类分析，所有碱基赋予相同权重，自展循环1 000次，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病原菌菌落与形态特征

在PDA培养基上，培养菌落近圆形，该菌株外观呈白色，菌丝致密，整个菌株生长较慢，中央隆起，气生菌丝呈茸毛状（如图2-A）;培养皿反面菌落呈黄色，有褶皱，黄色菌上长有白色菌丝，菌丝较短（如图2-B）。22 ℃培养5天后，菌落和菌丝表面可见散布分生孢子盘。

分生孢子呈棍棒状纺锤形，5个细胞，长（20.5～

27.5）μm×（5.2～7.6）μm;中间2个有色细胞颜色较深，长15.7～18.1 μm，两端细胞色浅;孢子顶端有2～3根附属丝，长10.9～16.8 μm;基部附属丝长3.9～5.8 μm。

根据分离物的菌落和分生孢子形态特征，初步鉴定为木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）（如图2）。

2.2 分子鉴定

本研究以3个分离菌DNA为模板，对其微管蛋白TUB2基因进行PCR扩增并测序。经NCBI Blastn确定3个菌株同属于拟盘多毛孢属木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi），与形态学鉴定的结果一致。

代表菌株KLXY-7-2的TUB2基因序列与拟盘多毛孢属其他同属菌株序列经最大简约法（MP）构建的系统发育树中，与2株木防已拟盘多毛孢菌（EF055226.1，EF055231.1）亲缘关系最近，以100%的支持率（Bootstrap=100%）聚为一个独立的进化分支（如图3）。因此，根据分离所得鉴定结果将KLXY-7-2菌株鉴定为木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。

3 结论与讨论

通过扩增拟盘多毛孢菌的TUB2基因序列，将代表菌株KLXY-7-2序列与GenBank中已有序列做比对，聚类分析与序列分所得析结果显示，拟盘多毛孢菌形成2个大的聚类群。该菌株形态特征与赵光材等[3]、吴文能等人[4]

描述的木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）基本一致。此外，通过病原菌的分离与纯化、形态学鉴定和微管蛋白基因（TUB2）构建系统发育树等多种检测方法，对引起贵州油茶叶枯病的病原物进行了系统性鉴定，分离菌株的基因序列与参考序列号的相似率为99%。因此，从形态学和分子方面证明該病原菌是木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。在明确该致病菌种类后，后期将在室内和田间开展筛选低毒高效杀菌剂的研究工作，为油茶病害的绿色防控提供科学依据。本研究所鉴定的油茶木防已拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）在贵州油茶病害研究中未见报道。

由于拟盘多毛孢属真菌与寄主植物种类之间无特异专化性，植物中普遍存在，种间形态特征差异不显著，区分难度大，对病原菌鉴定与病害防治造成一定的困难，ITS1-TUB2序列相结合对拟盘多毛孢属绝大多数种类起到较好的鉴别作用。因此，今后对病原菌采用形态特征结合多个基因位点的系统鉴定很有必要。

参考文献：

[1] 卢东升，黄新华，代兵.信阳市油茶病害及其病原鉴定[J].东北林业大学学报，2012，40（5）：83-85，111.

[2] 牛晓庆，陈良秋，付登强，等.油茶叶枯病菌的鉴定及生物学特性研究[J].热带作物学报，2013，34（2）：352-357.

[3] 赵光材，李楠.拟盘多毛孢属在云南的34个种[J].东北林业大学学报，1995（4）：21-27.

[4] 吴文能，雷霁卿，李江阔，等.蓝莓采后病害病原菌分离鉴定及抑菌药剂筛选[J].北方园艺，2019（7）：58-64.

（责任编辑：赵中正）