血清长链非编码RNA MALAT1和AFAP1-AS1与鼻咽癌临床病理特征和预后的关系

刘耿淳 申良方

鼻咽癌是一种在中国南方发病率较高的恶性肿瘤，被认为是由爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒感染和其他环境因素引起。早期治疗鼻咽癌效果较好，5年生存率达85%[1-3]。然而，由于早期临床症状不典型、不明显，加上鼻咽癌病变较深且与颅底密切相关，鼻咽癌易迁移至颅底、咽旁区、颈动脉鞘等周围组织，因此，探寻早期鼻咽癌诊治分子标志物具有重要意义。长链非编码RNA(lncRNA)被定义为长于200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA参与基因表达的多级调控，包括表观遗传、转录和转录后水平。异常的lncRNA通过促进转录调节驱动癌症[4-5]。lncRNA在癌症相关基因调控系统中起关键作用，其表达紊乱可促进癌细胞增殖、侵袭和转移。最近研究已证实lncRNA在血清或血浆中以可测量的水平存在，具有高稳定性，使其成为有前景的生物标志物[6]。血清循环RNA MALAT1可以区分肝癌患者和健康对照，并且AFAP1-AS1可以作为用于胃癌诊断和预后预测的新型血清生物标志物。本研究拟探讨血清lncRNA MALAT1和AFAP1-AS1与鼻咽癌临床病理特征和预后的关系，为鼻咽癌的诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2013年4月—2015年6月在中南大学湘雅医学院第六临床医院经病理证实的鼻咽癌患者136例为研究对象，符合美国国家综合癌症网(National Compre hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《NCCNCRC诊治指南》中的诊断标准。鼻咽癌患者中男70例，女66例，年龄27～72岁，平均(55.45±5.63)岁。根据2008 TNM鼻咽癌分期系统，Ⅰ期25例，Ⅱ期32例，Ⅲ期48例，Ⅳa期20例，Ⅳb期11例。所有患者均通过组织病理学诊断确诊，并进行了明确的TNM分期。该研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者及家属均签署书面知情同意书。在涉及人类参与者的研究中进行的所有程序均符合国家研究委员会的道德标准和赫尔辛基宣言中的道德标准。选择我院2015年1月—5月的门诊健康体检者54例为对照组，其中男25例，女29例，年龄26～70岁，平均(55.87±5.14)岁。鼻咽癌组及对照组自愿提供血清，用于分析lncRNA MALAT1和AFAP1-AS1的表达及其与临床病理特征的关系。排除标准：其他肿瘤患者；参与者重要内脏器官的功能障碍或失败，包括肝脏、肾脏、心脏等；参与者在研究前进行了放化疗。

1.2 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表达水平的测定

使用TRIzol Reagent提取血清总RNA。使用SMA 400 UV-vis检测分离的RNA的浓度和纯度。使用逆转录系统试剂盒从RNA样品合成互补DNA(cDNA)。使用标准SYBR Green PCR试剂盒方案和在CFX96实时上的TaqMan miRNA测定进行lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的实时PCR。lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表达结果通过内参基因GAPDH均一化，并通过2-ΔΔCt方法计算。本试验中特异性引物如下：MALAT1上游序列5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下游序列5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；AFAP1-AS1上游序列5′-CTAGTCTAGAGTCGCTGTTAT CTCATTGTCTG-3′，下游序列5′-CGCGGATCCT CTGCTTCTGTCACAGAATC-3′；GAPDH上游序列5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，下游序列5′-TG TATCCAAACTCATTG TCATAC-3′。定量PCR的反应条件如下：95℃10 min，45个循环，95℃20 s，60℃30 s，72℃20 s。PCR体系为：10 μL 2×QuantiTect SYBR Green RTPCR Master Mix、1.0 μL正向和反向引物(0.5 μm/L)、2 μg模板RNA、0.5 μLQuantiTectRT Mix和dd H2O。为分析lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表达水平与鼻咽癌患者临床病理特征关系，定义2-ΔΔCt≤2为低表达，2-ΔΔCt>2为高表达[7]。

1.3 随访

随访开始日期为出院日期，随访结束日期为2018年12月31日，随访方式为门诊及电话随访，随访内容为患者出院后生存状况，终点事件为死亡、随访时间截止及删失，总生存期(OS)为出院至出现终点事件时间。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 对照组和鼻咽癌组中lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平的表达

与对照组比较，鼻咽癌组lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达水平明显升高(P<0.001)(表1)。

2.2 鼻咽癌患者lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达与临床病理特征的关系

lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达与年龄无关(P>0.05)；与肿瘤最大径、病理学分级、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发有关(P<0.05)，且肿瘤最大径≥5 cm、病理学分期越高、TNM分期越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、有复发的鼻咽癌患者lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表达率越高(表2)。

2.3 lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达水平与患者预后分析

lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表达组2年生存率及总生存期均明显高于lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表达组(P<0.001)(图1，表3)。

表1 对照组和鼻咽癌组中lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平的表达

表2 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达与鼻咽癌患者临床病理特征的关系

表3 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1蛋白表达水平与患者预后分析

图1 lncRNA MALAT1/AFAP1-AS1高表达组与低表达组Kaplan-Meier生存曲线比较

2.4 预后多因素分析

将患者年龄、肿瘤直径、病理学分级、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移与否等临床特征及KPS评分和血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达等变量纳入多因素Cox逐步回归分析，结果发现年龄≥50岁(HR=1.92，95%CI：1.06～3.46)和病理级别Ⅲ～Ⅳ级(HR=3.70，95%CI：2.08～6.61)为鼻咽癌患者OS的独立危险因素，lncRNA MALAT1低表达(HR=0.52，95%CI：0.37～0.81)和lncRNA AFAP1-AS1低表达(HR=0.56，95%CI：0.51～0.83)为鼻咽癌患者OS的独立保护因素(P<0.001)(表4)。

表4 鼻咽癌患者OS多因素逐步Cox回归分析结果(n=136)

3 讨论

越来越多的证据表明，真核转录组和基因组不是蛋白质编码基因转录的简单底物，lncRNA才是。lncRNA可能作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用。已发现lncRNA的表达经常在癌细胞中失调[8]。

lncRNA MALAT1基因长度为2.6 kb，由4个外显子组成。lncRNA MALAT1成为编程分化细胞转变为多能干细胞的重要参与者。lncRNA MALAT1可促进肝细胞癌、乳腺癌、乳腺干细胞和神经胶质瘤的进展。lncRNA MALAT1通过阻止细胞应激途径(包括p53反应)的激活在调节乳腺癌中起关键作用[9-10]。lncRNA MALAT1是缺氧反应性lncRNA，其通过miR-145参与肝细胞癌中缺氧信号传导。恶性肿瘤的发生和发展与细胞的过度增殖密切相关[11-12]。由于癌细胞增殖过程中消耗大量氧气，缺氧是肿瘤发展的常见原因。缺氧可使癌细胞改变其生物学行为以适应缺氧环境，从而增加其侵袭性和转移潜能。在这种情况下，癌细胞生长所需的能量主要来自无氧糖酵解。因此，随着癌细胞转移的进展，lncRNA MALAT1的表达继续增加以满足癌组织中葡萄糖代谢的需求。lncRNA MALAT1是跨膜葡萄糖输入的重要细胞载体，并且是葡萄糖转运的重要调节因子；在正常组织或良性肿瘤中未检测到lncRNA MALAT1表达，而在恶性肿瘤中通常发现高水平的lncRNA MALAT1，其机制是lncRNA MALAT1增加葡萄糖摄取和转运[13-14]。因此，lncRNA MALAT1被认为是细胞恶性肿瘤的早期标志物之一。目前，大量研究表明lncRNA MALAT1在多种肿瘤中过表达，其表达水平与临床分期和转移密切相关。

在大多数鼻咽癌患者中发现持续潜伏的EB病毒感染，表明其在鼻咽癌的发生和发展中的病因学作用。AFAP1-AS1是一种新鉴定的lncRNA。AFAP1-AS1的高表达与鼻咽癌患者的转移和预后不良有关[15-16]。因此，AFAP1-AS1可能是鼻咽癌诊断生物标志物和预后因素。研究发现EB病毒感染后NP69细胞中AFAP1-AS1的水平显著增加。AFAP1-AS1最初被鉴定为非小细胞肺癌的预后标志物，然后发现在一系列肿瘤类型中上调。AFAP1-AS1通过充当miR-25的靶基因进而促进肝癌的发生和进展。体外细胞试验表明，AFAP1-AS1敲低抑制了NPC细胞的转移、体外侵袭和增殖。进一步的qRT-PCR检测显示AFAP1-AS1影响与转移、侵袭和细胞周期相关的基因的表达。这说明AFAP1-AS1参与鼻咽癌进展过程[17-18]。

本研究结果显示，与对照组比较，鼻咽癌组lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达明显升高；lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表达与肿瘤最大径、病理学分级、TNM分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发相关，且肿瘤最大径≥5 cm、病理学分期越高、TNM分期越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、有复发，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表达率越高。这与上述讨论癌组织中MALAT1、AFAP1-AS1高表达相符合，同时说明鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平升高，且与鼻咽癌恶性进展有关。与此同时，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表达组2年生存率及总生存期均明显高于lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表达组；多因素Cox回归分析显示，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表达为鼻咽癌患者预后的保护因素，说明血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表达的鼻咽癌患者预后良好。

本研究实验样本偏少，且未探讨MALAT1、AFAP1-AS1与鼻咽炎发病的分子机制联系，这将在后续研究中完善。综上所述，鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平升高，且与鼻咽癌恶性进展有关；鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表达患者预后良好；MALAT1、AFAP1-AS1有望诊断鼻咽癌的新型标志物。