血清中microRNA-127对鼻咽癌患者化疗抗性的预测价值

阮 鹏 谭爱丽

鼻咽癌是我国发病率较高的头颈部恶性肿瘤之一，在我国南方部分地区，鼻咽癌的发病率高达20/10万[1]。鼻咽癌起源于鼻咽的黏膜上皮，因肿瘤原发灶的特殊解剖结构，病理上多表现为低分化肿瘤，具有极强的侵袭性，大多数鼻咽癌患者确诊时多处于肿瘤晚期阶段[2]。近年来随着影像学诊断的进步、放疗和化疗方案的更新，鼻咽癌的治愈率得到提高，但复发转移的发生仍是治疗失败的主要原因[3]。此外，即使是同一TNM分期的患者，在化疗疗效和预后上仍存在较大的差异[4]。因此如何有效预测鼻咽癌患者的化疗效果和生存预后，对制定鼻咽癌患者的个性化治疗方案具有重要的指导价值。

微小RNA(micro RNA，miRNA)是一类长度仅为18～22个核苷酸的小非编码RNA，在转录后水平调节基因表达，参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡和转移侵袭等过程[5]。同时肿瘤细胞可释放miRNA入外周血，而外周血中的miRNA稳定性较强，作为新兴生物学标志物方面具有重要的临床价值。有研究发现miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a在鼻咽癌中显著上调，但它们在血清中的表达量及对患者化疗抗性的预测价值尚不清楚[6-7]。因此本研究主要评估血清中miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a对预测鼻咽癌患者化疗疗效和远期生存预后的临床价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象

本研究经本院伦理委员会审核通过，并经患者及其家属签署知情同意书。连续性纳入2010年1月—2016年12月在武汉大学人民医院确诊并接受治疗的鼻咽癌患者。纳入标准：(1)年龄大于18周岁；(2)经组织病理学诊断确诊为鼻咽癌；(3)接受以顺铂为基础的一线化疗方案；(4)行为状态评分(Karnofsky performance status，KPS)在60分以上；(5)肝肾功能正常。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并感染性或其他炎症性疾病；(3)随访资料不详。共纳入187例鼻咽癌患者，其中男134例，女53例，年龄23～76岁(平均45.7±12.6岁)。同时纳入60例健康体检人群作为对照。

1.2 临床资料收集

通过病史系统收集患者的人口统计学资料和临床病理学特征，包括性别、年龄、KPS评分、肿瘤病理诊断、化疗方案等。还包括各项实验室检查和血清EV病毒抗体水平，包括EA/IgA和VCA/IgA。

1.3 化疗方案

入组的患者均接受以顺铂为基础的化疗方案。187例患者中，97例接受PF方案：顺铂(25 mg/m2，iv，d1-3)和5-氟尿嘧啶(500 mg/m2，iv，d1-5)，每3周进行一次；56例接受TP方案：顺铂(25 mg/m2，iv，d1-3)和紫杉醇(175 mg/m2，iv，d1)，每3周进行一次；余34例接受其他治疗方案。化疗周期的中位数为4(范围2～12)。

1.4 血清miRNA检测

1.4.1 血液样本中循环miRNA提取 鼻咽癌患者入院后在初次化疗前空腹采血，对照组人群于体检当天清晨空腹采血，置于EDTA抗凝管中，静置30 min后，2000 r/min离心5 min，分离上层血清，置于-80℃冰箱中储存。通过miRNeasy mini kit外周血RNA提取试剂盒提取500 μL血清中的miRNA，并最终以20 μL的DEPC水洗脱，Nanodrop 2000测定RNA吸光度A260/A280介于1.8～2.0之间者可用于逆转录反应。

1.4.2 逆转录和实时荧光定量PCR 调整RNA浓度值500 ng/μL用于逆转录成cDNA，反应体系：2×miScript II RT Mix 10 μL+2 μL RNA+8 μL DEPC水，共20 μL；反应条件：45℃ 30 min，85℃10 min。实时荧光定量PCR检测6种miRNA，包括miR-127、miR-144、miR-149、miR-155和miR-18a，使用U6 snRNA作为内参。引物序列见表1。所有反应都设3复孔和空白对照，反应体系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL+前/后引物混合物(5 μmol/L)1 μL+cDNA 1 μL+DEPC水 8 μL，共20 μL，反应条件：94℃ 2 min，40个PCR循环(94℃ 15 s，62℃ 30 s)。扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数为Ct值，△Ct则为每个样品的待测miRNA的Ct值与内参U6 snRNA的Ct值的差值，并以2-△△Ct作为循环miRNA的相对表达水平。

1.5 化疗效果评估

化疗结束后，根据实体瘤疗效评价标准(RECIST 1.0)评估治疗反应[8]，包括完全缓解(Complete response，CR)、部分缓解(Partial response，PR)、疾病稳定(Stable disease，SD)和疾病进展(Progressive disease，PD)，其中CR和PR定义为化疗敏感组(123例)，SD和PD定义为化疗抵抗组(64例)。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 鼻咽癌化疗敏感与抵抗患者的临床资料比较

与化疗敏感组相比，化疗抵抗组T3-4期比例、N3期比例、TNM Ⅲ～Ⅳ期比例更高，差异存在统计学意义(P<0.01)，但年龄、性别、EA/IgA滴度、VCA/IgA滴度无统计学差异(表2)。

表1 荧光定量PCR引物序列

表2 敏感与抵抗患者的临床资料比较[n(%)]

2.2 血清miRNA水平比较

鼻咽癌患者血清miR-127水平显著高于健康对照组(4.3±1.6vs. 1.4±0.5，P<0.001)，但其它血清miRNA在两组间无统计学差异(P>0.05)(图1)。亚组分析发现，化疗抵抗组患者的血清miR-127水平显著高于化疗敏感组患者(4.5±1.3vs. 3.8±1.7，P<0.001)。

2.3 血清miR-127对化疗抵抗的预测价值和阈值

通过ROC曲线分析显示，血清miR-127对鼻咽癌患者化疗抵抗价值较高(AUC=0.702，P<0.001)，血清miR-127对化疗抵抗的预测阈值为4.2，灵敏度82.3%，特异度76.3%(图2)。

图1 鼻咽癌患者与健康人群的血清miRNA比较

2.4 血清miR-127与化疗反应性的关系

化疗抵抗组血清miR-127≥4.2比例显著高于化疗敏感组(78.1%vs. 30.1%，P<0.001)(表3)。

2.5 鼻咽癌患者化疗抵抗的影响因素分析

将表1中存在统计学差异的参数以及血清miR-127水平纳入多因素Logistics回归分析中，结果显示，TNM分期(OR=1.655，95%CI：1.142～2.584，P=0.016)和血清miR-127≥4.2(OR=2.231，95%CI：1.762～4.503，P=0.001)是影响鼻咽癌患者化疗抵抗的独立危险因素(表4)。

图2 血清miR-127水平预测化疗抵抗的ROC曲线分析

表3 血清miR-127与化疗反应性相关性[n(%)]

表4 影响鼻咽癌患者化疗抵抗的多因素分析

3 讨论

鼻咽癌化疗抵抗是多种遗传因素导致的复杂且多步骤过程，如抗凋亡基因的上调、抑癌基因的下调和药物代谢基因的改变等[9]。因此研究影响鼻咽癌化疗抵抗的分子机制和寻找化疗敏感性标志物是目前临床上备受关注的问题。目前主要通过血液标志物、免疫组织化学检查等评估鼻咽癌患者的生存预后，但针对化疗抗性的标志物研究较少。

miRNA是一类高度非编码的小RNA分子，可结合到目标mRNA的3′非编码区以调节目标mRNA的降解，从而抑制蛋白的表达。近年来的研究表明miRNA可作为促癌基因或抑癌基因而对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和耐药能力具有调控作用[10]。而在鼻咽癌中，miRNA也参与了鼻咽癌的发生发展及耐药，并可作为标志物对鼻咽癌进行分子分型[11]。但如何通过miRNA的检测来判断鼻咽癌患者的化疗抗性是目前研究的热点。

miR-127位于第14号常染色体q32.2区域内，在多种恶性肿瘤中表达上调，包括鼻咽癌、胃癌、肺癌等[12-13]。miR-127能够激活NFκB-TNFα信号通路而促进肿瘤细胞的上皮间质转化，从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和化疗耐药。此外，miR-127还能够直接抑制抑癌基因SEPT7和BCL6的蛋白表达，从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭[14-15]。肿瘤细胞可分泌miRNA至外周血中，血清中的miRNA水平可作为一种理想的肿瘤标志物[16]。Lu等[17]发现乳腺癌患者血清内miR-127水平显著上调，并且上调的miR-127能够提高对乳腺癌的诊断准确性；You等[18]则发现血清miR-127的上调能够有效鉴别宫颈癌，并且与宫颈癌患者的远期生存预后不良密切相关。在本研究中，我们也发现了鼻咽癌患者血清中miR-127水平显著高于正常人群，并且升高的miR-127与鼻咽癌患者的化疗抵抗密切相关。通过ROC曲线分析证实血清中miR-127≥4.2是预测鼻咽癌患者化疗抵抗的最佳阈值，进一步通过多因素回归分析确定血清miR-127水平升高是预测鼻咽癌化疗抵抗的独立危险因素，提示了血清miR-127水平可作为有效预测鼻咽癌患者化疗抗性的有效标志物。

综上所述，本研究证实鼻咽癌患者的血清miR-127水平显著上调，与鼻咽癌患者化疗抵抗密切相关，是预测鼻咽癌患者化疗抵抗的独立危险因素。但由于本研究仅为单中心、小样本回顾性研究，因此仍需要扩大样本量来进一步证实本研究，并将血清miR-127检测应用于临床实践中。