大孔树脂分离纯化毛蕊花糖苷的研究

苏 娅 孔 征 霍仕霞 姜 萌 闫 明

1.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药剂室，新疆乌鲁木齐 830049

肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Ma 或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight干燥肉质茎，具有补肾阳、益精血等功效。至今，已从肉苁蓉分离鉴定出苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、木质素类等近百种化合物[1]。毛蕊花糖苷是苯乙醇苷类主要药效成分之一，其抗衰老、提高记忆力、神经保护等药理作用已被证实[2-3]。课题组前期对其改善脑损伤、改善学习记忆障碍、抗氧化、保护神经细胞等方面也进行了研究[4-9]。本文对毛蕊花糖苷进行了热、动力学及分离纯化研究，为后期大规模分离纯化毛蕊花糖苷原料药的制备工艺提供数据支撑。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

日本岛津高效液相色谱仪：LC-20AB 泵，SPDM20A 二极管阵列检测器，CBM-20A 系统控制器，CTO-20A 柱温箱，SIL-20A 自动进样器；BDS HypersilC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；SQP 电子天平（万分之一，赛多利斯科学仪器有限公司）；SHZ-ZA水浴恒温振荡器（上海梅香仪器有限公司）；UPS-1-40L优普系列超纯水器（乌鲁木齐洁新环保设备有限公司）。

1.2 试剂

毛蕊花糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111530-201512，96.7%）；95%乙醇（梅河口市阜康酒精有限公司）；甲醇（色谱纯）；甲酸（分析纯）；去离子水（自制）。

1.3 材料

管花肉苁蓉提取毛蕊花糖苷浸膏；层析柱；D101树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；国产HP-20树脂（安徽三星科技有限公司）；三菱HP-20树脂（北京英莱克科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件

流动相：甲醇-0.2%甲酸（40∶60）；色谱柱：C18色谱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35℃；检测波长：330 nm。

2.1.2 对照品储备溶液的制备

精密称取毛蕊花糖苷对照品21.2 mg，50%甲醇定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，即得毛蕊花糖苷对照品储备液，备用。

2.1.3 线性关系考察

精密量取2 mL 毛蕊花糖苷对照品储备液于10 mL容量瓶中，以50%甲醇定容至刻度，得410 μg/mL 对照品溶液，逐级稀释分别得到205.00、102.50、51.25、25.63、12.81、6.41、3.20 μg/mL 对照品系列溶液。以峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=21522X-4502.9，r=1，线性范围为3.20～410 μg/mL，平均加样回收率为99.61%，RSD 为1.80%。

2.2 纯化工艺研究

2.2.1 供试品溶液的制备

取自制肉苁蓉毛蕊花糖苷浸膏90 g 用去离子水溶解定容至2000 mL，过滤，得到供试品溶液（1.5 mg/mL），HPLC 检测，采用外标一点法进行分析。

2.2.2 大孔树脂的预处理

将大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h，再用去离子水洗至流出液无白色浑浊且无醇味，备用[10-12]。

2.2.3 大孔树脂型号的选择

取毛蕊花糖苷浸膏，配置成浓度为1 mg/mL 的药液。准确称取国产HP20、三菱HP-20、D101大孔树脂2 g，加入40 mL 的药液，于恒温水浴锅振荡器中振摇24 h（25℃，85 r/min），测定吸附后溶液中毛蕊花糖苷含量，计算吸附率（X1）；将吸附后树脂用纯水洗至流出液无色，再用95%乙醇40 mL 进行解吸，得到解吸率（X2）。X1（%）=（C0-C1）/C0；X2（%）=（C1-C2）/C1；式中C0为溶液的初始浓度，mg/mL；C1为吸附后溶液的浓度；C2为解吸后溶液的浓度。国产HP-20树脂与D101树脂吸附及解吸性能均优于三菱HP-20树脂。从经济等多方面考虑，选择D101树脂进一步考察其对毛蕊花糖苷的吸附分离特性。见表1。

表1 不同型号树脂对毛蕊花糖苷的吸附率和解吸率（%）

2.2.4 动力学研究

2.2.4.1 吸附动力学模型 吸附过程主要分为3个阶段：液膜扩散阶段、颗粒内扩散阶段、吸附反应阶段[13-14]，采用3种模型进行拟合，颗粒内扩散模型：Qt=kit0.5+C；准一级吸附动力学模型：ln（Qe-Qt）=-k1t+lnQe；准二级吸附动力学模型：t/qt=1/k2qe2+t/qe。式中：Qt为t时刻的吸附量；Qe 为吸附平衡时刻的吸附量，mg/g；ki为内扩散速率常数，mg/（g·min0.5）；k1为一级吸附速率常数，1/min；k2为二级吸附速率常数，g/（mg·min）；C为常数。

2.2.4.2 静态吸附动力学的考察 取预处理后树脂10 g，加入100 mL，按“2.2.1”项下的管花肉苁蓉供试品溶液，在不同温度下（25、30、35、40℃）恒温水浴振荡24 h，每隔一段时间测定溶液中毛蕊花糖苷的含量并计算单位吸附量。随着吸附时间的延长，大孔树脂对肉苁蓉毛蕊花糖苷的吸附量随之增加。在初始阶段吸附量增长较快，吸附4.5 h 后，静态吸附基本达到平衡，最大吸附值为12.7096 mg/g。见图1。

图1 D101大孔树脂对毛蕊花糖苷的静态吸附动力学曲线

2.2.4.3 大孔树脂吸附管花肉苁蓉毛蕊花糖苷动力学研究 根据上述结果，吸附过程在4.5 h 内基本达到平衡，分别绘制0～4.5 h 内Qt与t0.5、ln（Qe-Qt）与t、t/qt与t 的拟合曲线图，见图2。其准二级吸附动力学拟合曲线的相关系数R2＞0.9998，D101型大孔树脂吸附管花肉苁蓉毛蕊花糖苷的过程更符合准二级吸附动力学模型，该吸附过程的吸附速率受化学吸附机制的控制。见表2～3。

图2 颗粒内扩散、准一级吸附、准二级吸附动力学拟合曲线

表2 动力学拟合参数

2.2.4.4 吸附反应活化能 本研究选择准二级吸附动力学模型中的k2作为吸附反应速率，根据Arrhenius 方程：lnk=-Ea/（RT）+A，绘制lnk 对1/T 的拟合曲线：lnk=-5769.9/T+14.277，R2=0.9831，求得活化能Ea=47.97 kJ/mol。

2.2.5 热力学研究

2.2.5.1 等温吸附曲线 在不同温度下（25、30、35、40℃），对管花肉苁蓉中毛蕊花糖苷进行静态吸附实验，取树脂10 g，共4份，加入100 mL 不同浓度的管花肉苁蓉供试品溶液（含毛蕊花糖苷0.1、0.15、0.2、0.3 g），恒温水浴锅振荡24 h，吸附平衡后计算平衡吸附量。不同温度下，D101型大孔树脂对毛蕊花糖苷的等温吸附曲线。见图3。为进一步了解该吸附过程的吸附规律，分别用Freundlich（F）、Langmuir（L）方程对其进行拟合[15]。L 方程：Ce/Qe=1/KQ0+Ce/Q0；F 方程：logQe=logk+1/nlogCe。式中：Ce为溶液的平衡浓度，mg/mL；Qe为平衡浓度为Ce时树脂的吸附量，mg/g；K，Q0为L 方程参数；k，n 为F 方程参数。R2大于0.9932。见表4。

表3 回归方程

图3 D101大孔树脂对毛蕊花糖苷的静态吸附等温线

2.2.5.2 吸附热力学参数的计算 吸附焓变△H[15]：lnCe=-lnk0+△H/RT；吸附自由能△G：△G=-nRT；吸附熵变△S：△S=（△H-△G）/T。式中：R 为气体常数8.314 J/（mol·K）；T 为热力学温度；n 为吸附强度；k0为热力学方程参数。△H、△G 为负值。见表5。

表4 热力学参数

表5 静态吸附热力学参数

2.2.6 最大上样量的考察

取管花肉苁蓉供试品溶液通过层析柱，每0.3 BV收集一次流出液，测定毛蕊花糖苷质量，以上样柱体积为横坐标，泄漏量为纵坐标，制作泄露曲线，考察树脂的最大上样量[16-18]。上样体积为6 BV 时，毛蕊花糖苷的泄漏量开始突增。见图4。

图4 泄露曲线

2.2.7 上样速度的考察

取供试品溶液6 BV，分别以流速1、2、3 BV/h 上样吸附。随着上样速度的增加，毛蕊花糖苷泄漏量越来越大，泄露率分别为0.04%、0.39%、1.04%，3个流速泄露均较少，选择2 BV/h 流速进行上样。

2.2.8 水洗量的考察

上样后用去离子水以3 BV/h 的速度洗脱除去水溶性杂质及未吸附的毛蕊花糖苷，每1 BV 收集1次水洗液，测定毛蕊花糖苷含量，在水洗体积至第8 BV时毛蕊花糖苷含量变化较小，但在此时水洗脱液中依旧有颜色，故继续洗脱至11 BV，毛蕊花糖苷含量基本不变且洗脱液澄清透明。

2.2.9 洗脱溶剂的考察

取水洗后柱子进行洗脱溶剂梯度洗脱，以10%乙醇-60%乙醇的顺序以3 BV/h 的速度洗脱，每个梯度洗脱3 BV，分别测定其毛蕊花糖苷含量，考察不同乙醇浓度对洗脱效果的影响，选择较优洗脱方法。30%乙醇洗脱液纯度最高。见表6。

表6 不同乙醇浓度洗脱的纯度

2.2.10 洗脱剂用量

按“2.2.9”项下洗脱溶剂洗脱10 BV，每1 BV 接收1次洗脱液并测定毛蕊花糖苷含量，当洗脱至第10 BV 时，毛蕊花糖苷含量较低为0.0702 mg/mL。

2.2.11 工艺验证

按上述优化的工艺，以D101大孔树脂进行验证试验，获得的毛蕊花糖苷含量分别为25.10%、23.76%、24.24%，与原管花肉苁蓉提取物浸膏中毛蕊花糖苷含量为3.33%相比较，毛蕊花糖苷含量有明显提高。

3 讨论

本研究通过筛选，确定了使用D101大孔树脂分离纯化毛蕊花糖苷的最佳工艺：上样液浓度为1.5 mg/mL，最大上样量为6 BV，上样速度为2BV/h，依次用11 BV的纯化水，10 BV 的30%乙醇进行洗脱。

在动力学研究中可知该吸附过程为化学吸附，是由吸附剂与吸附质间的化学键作用力而引起的,吸附需要一定的活化能，有很强的选择性。△H 为负值，说明该吸附为放热过程，△G 为负值，表明反应为自发过程，该吸附可逆，△G 随着温度的升高而减小，说明升高温度不利于提高肉苁蓉毛蕊花糖苷的吸附量，△S 为负值，说明体系熵值减小；热力学研究中，D101树脂吸附等温线符合热力学方程。随着温度的升高，D101对肉苁蓉毛蕊花糖苷的吸附量越低，适当地降低温度，有利于吸附进行。发现两种方程拟合效果都较好，说明该吸附过程为单分子吸附和多分子吸附共同作用，结合动力学结果，应是以单分子吸附为主的吸附过程。毛蕊花糖苷为肉苁蓉中主要药效成分之一，分离纯化毛蕊花糖苷有重要意义。以往研究多为对苯乙醇苷这一类物质的纯化研究，且纯度较高，而对毛蕊花糖苷的研究很少，故本文对其进行了纯化工艺研究[19-20]。本研究确定的工艺简便，能较好地纯化管花肉苁蓉毛蕊花糖苷，且D101大孔树脂成本较低，可重复利用，适用于工业化生产。