脑脊液二代测序在病毒性脑炎与自身免疫性脑炎鉴别中的应用：基于5例患者的诊治经过

俞 越 石静萍 祝东林

南京医科大学附属脑科医院神经内科，江苏 南京 210029

近年来，自身免疫性脑炎成为神经病学领域的研究热点之一[1]。但目前在对该病的发现及认识过程中出现了过度诊断的问题，而忽略了其与病毒性脑炎的鉴别诊断[2]。由于自身免疫性脑炎强调早期免疫干预(如免疫球蛋白、大剂量激素、血浆置换、免疫抑制剂)[3-4]，不加鉴别的诊断泛化极有可能造成上述治疗方法的滥用，从而给患者带来沉重的负担和不可预料的伤害。因此，探索一种可靠的、快捷的方法对于自身免疫性脑炎与病毒性脑炎的早期鉴别至关重要[5]。本文通过介绍5例患者的诊治过程，探讨脑脊液二代基因测序(next generation sequencing，NGS)在自身免疫性脑炎与病毒性脑炎的早期鉴别诊断中的价值，为临床提供借鉴。

1 资料和方法

1.1研究对象收集2017-05—2019-05在南京脑科医院神经内科住院的5例患者，均经脑脊液NGS证实为病毒性脑炎，其中男3例，女2例；年龄分别为53岁、30岁、49岁、30岁、46岁；脑脊液送检至NGS报告时间分别为1 d、2 d、2 d、2 d、2 d，平均1.8 d。

1.2研究方法所有患者入院后行血清结缔组织病相关抗体、甲状腺自身抗体、甲状腺功能、脑脊液常规、生化、免疫、细胞学、血结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT)、脑电图、心电图、胸部CT、头颅MR平扫+增强或头颅ASL(动脉自选标记)等检查，同时行自身免疫性脑炎相关抗体、中枢神经脱髓鞘相关抗体、副肿瘤综合征相关抗体检测[德国欧蒙医学实验室(杭州)]。同时留取脑脊液送至华大基因研究院(天津华大医学检验所)进行NGS检测。NGS可以对样本中微生物核酸序列进行高通量测序分析，随后通过序列比对(与数据库中已有微生物的核酸序列)，从而鉴定出现样本中存在的微生物。检测过程包括操作及分析，具体检测方法参见GUAN等[6-8]报道。根据覆盖度(指检测到的该微生物核酸序列长度占该微生物整个基因组序列长度的百分比)、深度(指检测到的该微生物碱基总量与检测到的该微生物基因组序列长度的比值，评价该测序量的指标之一)、Reads(指所测微生物的一段核酸序列)、Unique Reads数(指比对上该微生物的Reads中，唯一比对到该微生物基因组序列的Reads条数)并结合临床判断患者的致病微生物。所有患者确诊后给予阿昔洛韦抗病毒治疗，并根据患者病情使用小剂量激素(≤200 mg)或大剂量激素冲击(甲强龙500 mg)治疗。所有患者知情同意并签署知情同意书。

2 结果

2.1前驱症状或前驱事件5例患者中4例出现前驱症状，且均表现为发热头痛，但无咽痛流涕、咳嗽咳痰、腹痛腹泻、尿频尿急尿痛等其他症状。

2.2临床表现5例患者前驱症状后出现认知障碍(如不认识家人、不理解别人文化、外出迷路、反应迟钝、记忆减退、计算障碍等)，且3例同时出现精神行为异常(如胡言乱语、打人骂人等)，1例同时出现运动障碍(行走不稳、一侧肢体轻偏瘫)。从前驱症状到临床表现出现的时间最长1个月，最短2 d。

2.3脑电图5例患者中3例脑电图出现中度或中重度异常脑电图，且均为弥漫分布的慢波节律，另外2例仅提示轻度异常脑电图。但脑电图改变程度与病灶范围、症状轻重不平行，因为其中1例颅内多发病灶，症状较重(认知障碍+精神行为异常+运动障碍)，但脑电图仅提示轻度异常。

2.4头颅MR表现5例患者中4例出现一侧或两侧(2例)边缘系统(颞叶、岛叶、额叶)异常信号，另外1例未发现明显异常(患者4)。见图1。

2.5腰穿脑脊液检查在入院后第1次腰穿中，白细胞计数最少为29个/μL(图1中患者1)，最多为360个/μL(图1中患者2)，细胞分类均以淋巴细胞为主，其他脑脊液检查，如葡萄糖、氯化物、总蛋白、脑脊液病毒及结核杆菌核酸检测均未见明显。

2.6血清或脑脊液中自身抗体检测所有患者检测了自身免疫性脑炎相关抗体(包括抗NMDA、AMPA1、AMPA2、GABA B、LGI 1、CASPR2抗体)、中枢脱髓鞘疾病相关抗体(包括抗NMO、MBP、MOG抗体)、副肿瘤综合征相关抗体(包括抗Hu、Yo、Ri、CV2、Amphophysin、ANNA-3、Tr、PCA-2、GAD、Ma2、PNMA2抗体)。所有上述抗体检测结果均为阴性。

2.7其他检测血清结缔组织病相关抗体、甲状腺激素及抗体、血结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT)、心电图、胸部CT、真菌检测等均未发现明显异常。

2.8脑脊液NGS共检出人类疱疹病毒Ⅰ型(即单纯疱疹病毒)2例，3型(即水痘带状疱疹病毒)1例，5型(即人巨细胞病毒)1例，以及1型、2型及4型(即人EB病毒)混合感染1例，见表1。其中1例患者治疗过程中出现面部纵行带状疱疹(图2)，更加验证了脑脊液NGS的结果。

图1 5例患者的头颅MR(T2相)及脑脊液病理(瑞氏染色，×400)。患者1：头颅MR示双侧额颞叶病灶，脑脊液中白细胞总数51个/μL；患者2：头颅MR示右颞叶病灶，脑脊液中白细胞总数360个/μL，同时因患者不配合而出现穿刺损伤，脑脊液中红细胞总数650个/μL；患者3：头颅MR示双侧颞叶病灶，脑脊液中白细胞总数29个/μL；患者4：头颅MR未见明显病灶，脑脊液中白细胞总数82个/μL；患者5：头颅MR示左颞叶病灶，脑脊液中白细胞总数85个/μL

图2患者4在抗病毒治疗过程中出现的面部纵行带状疱疹，进一步证实了该患者脑脊液二代测序的准确性

Figure2The facial herpes zoster in patient4during antiviral therapy further confirms the accuracy of second-generation sequencing of cerebrospinal fluid in this patient

表1 5位患者的脑脊液二代测序结果

2.9治疗及预后5例患者均给予阿昔洛韦联合激素治疗，其中 1例(患者1)因症状较重给予甲强龙500 mg起始并逐渐减量。疗程最短21 d，最长2个月。经上述治疗后，患者发热头痛、认知障碍、精神行为异常等均明显好转而出院，症状基本消失。出院后随访1个月，症状无反复。

3 讨论

根据2016年《Lancet Neurology》公布的自身免疫性脑炎诊断标准[9]，凡是新近(3个月以内)发生的记忆障碍、精神行为异常、意识改变或不明原因的癫痫发作，头颅MR提示单侧或双侧颞叶或其他边缘系统异常信号、脑脊液提示炎症改变，均应考虑自身免疫性脑炎可能。如发现相关抗体阳性，则可明确诊断。该标准亦提出“抗体阴性自身免疫性脑炎的诊断标准”，即只要临床表现、辅助检查并排除一些常见的疾病(如感染性疾病、代谢性与中毒性脑病、桥本脑病、肿瘤等)，即便抗体阴性亦可诊断自身免疫性脑炎。因此，本研究中5例患者均在3个月内以精神行为异常、认知障碍起病，头颅MR提示单侧或双侧边缘系统异常信号、脑脊液提示炎症改变，即便自身免疫性脑炎抗体阴性，仍不能排除自身免疫性脑炎的可能。尽管发热可作为感染的证据之一，但该5例患者并无其他感染症状或证据，而且发热亦是自身免疫性脑炎常见的前驱症状之一。

2017年《中华神经科杂志》公布的中国自身免疫性脑炎诊治专家共识中[10]，对于诊断“可能的自身免疫性脑炎”及“确诊的自身免疫性脑炎”均提出需“合理地排除其他病因”。而感染性疾病尤其是病毒性脑炎是鉴别的重中之重。实际上，病毒性脑炎仍是目前临床上最常见的无菌性脑炎，它的确诊依赖于脑脊液中病原学检测，包括病毒核酸检测[11-12]。但由于条件缺乏无法在所有医院开展自身免疫性脑炎和副肿瘤相关抗体检测[13]、脑脊液病毒核酸检测阳性率较低(目前仍主要采用第一代基因检测)[14-15]、病毒变异快耐药性增加[16-17]、医疗界对新鲜事物的过分追求等，自身免疫性脑炎的诊断迅猛增加，甚至有泛滥趋势，随之导致免疫调节药物亦出现滥用趋势。

NGS又称高通量测序、深度测序，源于该技术可以同时测定几百万甚至上亿条DNA或RNA序列，可为临床节约大量的时间成本[18]。同时，NGS通过无偏倚的“全病原体”筛查可快速、精准地测定感染病原体。使用NGS对脑脊液中游离核酸进行检测，并通过序列比对，鉴定出样本中存在的可疑致病微生物。随着数据库中微生物序列的迅猛增加，目前NGS可检测范围包括细菌、支原体、衣原体、立克次体及螺旋体，真菌、DNA病毒和寄生虫等在内的2 749种基因组序列已知的微生物[19]。相对于第一代基因测序，NGS在中枢神经系统感染的诊断方面具有无可比拟的优势：NGS可快速发现感染人体的已知病毒类型，发现已知病毒的潜在致病力，并发现可致病的全新病原体，如世界上首次报道的伪狂犬病毒(即猪疱疹病毒1型)所致人类脑炎是通过NGS鉴定并诊断出来的[20]。对于临床上不典型的、罕见的、治疗效果不好的脑膜炎或脑炎病例，运用脑脊液NGS有助于早期精准诊断，或提供早期鉴别诊断依据[21]。本研究中，自患者脑脊液样本送到、测序结束并完成结果分析平均耗时1.8 d，并明确感染病原体，使病情危重、治疗效果不好、或无法明确诊断的患者得到快速而精准的诊断。更为可观的是，本研究中除检测出临床上相对常见的人类单纯疱疹病毒1型感染，还检测出了相对少见的人类疱疹病毒3型(即水痘带状疱疹病毒)、4型(即人EB病毒)、5型(即人巨细胞病毒)，甚至检测出迄今未见报道的单纯疱疹病毒1型、2型及EB病毒的混合感染。避免了因长期诊断不明或治疗效果不好而盲目更改诊断(如更改诊断为自身免疫性脑炎)，或改用“大炮轰蚊子”的治疗方案(如采用激素冲击、免疫球蛋白、血浆置换等治疗或联合治疗)，从而避免对患者造成身心上的伤害和经济上的负担，为临床诊治策略提供了极大的帮助及信心。本研究中对该5例患者从始至终坚持使用抗病毒，避免了自身免疫性脑炎治疗中常用的丙种球蛋白、免疫抑制剂等免疫修饰治疗。患者经抗病毒治疗后获得良好的转归，与自身免疫性脑炎的转归不同，这验证了NGS结果的可靠性。其中1例患者面部出现的带状疱疹进一步验证了NGS的准确性。

值得注意的是，NGS的局限性亦来源于其高通量的优点。脑脊液NGS通常会获得多种疑似病原体基因序列[22]，如本研究5例患者脑脊液NGS中均出现覆盖度相对较多而深度均为1的痤疮丙酸杆菌(覆盖度分别为3.0%～8.6%，平均6.3%)，但通过查询文献得知该细菌感染与临床表现明显不符[23]，是NGS常见的背景污染菌[24]。该类与临床表现完全不符而出现在NGS结果分析中的病原体称为背景“噪声”，而对这种背景微生物目前尚无统一的认定，这是NGS的局限之一。因此，二代测序引入临床初期的目标之一，即是找出脑脊液NGS中常见的背景微生物，为NGS以后在临床的广泛应用提供参考[25]。其次，脑脊液NGS需要根据数据库中已知病原体基因组进行比对而得出结果。但对数据库中不存在的或目前未鉴定出来的病原体基因组，脑脊液NGS则无法发现这些病原体，这是NGS的局限之二。因此，脑脊液NGS更加全面的结果判断尚需基因组数据库的完善。

脑脊液NGS可为临床上自身免疫性脑炎与病毒性脑炎的鉴别提供快速而精准的依据。随着研究的进一步深入，未来NGS必将突破局限而被广泛用于各种疾病的早期诊断与治疗，从而实现国家所提倡的精准诊断、精准治疗的目标。