铁代谢相关蛋白在烧伤后增生性瘢痕中的表达

李冬军 赵连魁 李明 杨建民

[摘要]目的：探讨烧伤后增生性瘢痕患者中铁代谢相关蛋白的表达情况。方法：组织标本均来自2016年-2018年石家庄市第一医院烧伤整形外科住院患者。患者分三组：正常皮肤组、萎缩性瘢痕组、增生性瘢痕组。后两组患者分别采集瘢痕及其自身正常皮肤标本。术中采集标本，应用电感耦合质谱分析仪测定三组标本中组织铁含量。免疫组织化学染色检测增生性瘢痕中铁代谢相关蛋白转铁蛋白受体1 （transferrin receptor 1，TfR1）、铁蛋白（ferritin，FTL）、二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）、膜铁转运蛋白1（ferroportin 1，FPN1）等在增生性瘢痕中的表达。结果：三组正常皮肤组织中组织铁含量比较差异无统计学差异（P>0.05）。增生性瘢痕组：增生性瘢痕组织比自身正常皮肤组织中组织铁含量升高，差异有统计学意義（P<0.05）。免疫组化显示增生性瘢痕组中增生性瘢痕组织及自身正常皮肤组织中均有铁代谢相关蛋白的表达，多表达于胞浆中，在表皮层表达较强。其中DMT1（±IRE）、FPN1以及FTL在增生性瘢痕组织中表达量高于其自身正常皮肤组织（P<0.05）;TfR1在增生性瘢痕组织中表达量却降低（P<0.05）。结论：增生性瘢痕组患者瘢痕局部铁元素沉积过多，进而细胞内可能通过IRP/IRE系统调节铁的摄取和释放，而且推测主要依赖于TfR1以及FPN1的作用而非DMT1（±IRE）。

[关键词]增生性瘢痕;萎缩性瘢痕;转铁蛋白受体1;铁蛋白;二价金属离子转运蛋白1;膜铁转运蛋白1

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）12-0079-04

Expression of Iron Metabolism Related Proteins in Hypertrophic Scars after Burn

LI Dong-jun1，ZHAO Lian-kui1，LI Ming1，YANG Jian-min2

（1.Department of Burn and Plastic Surgery，the First Hospital of Shjiazhuang，Shijiazhuang 050011，Hebei，China;2.Department of Plastic Surgery，Tsinghua Changgeng Hospital，Beijing 102218，China）

Abstract： Objective  To study the expression of iron metabolism related proteins in hypertrophic scars of burn patients. Methods  Tissue specimens were collected from inpatients in burn and plastic surgery department of Shijiazhuang First Hospital from 2016 to 2018. The patients were divided into three groups： the normal skin group， the atrophic scar group and the hypertrophic scar group. In the latter two groups， scars and normal skin specimens were collected. Specimens were collected during the operation. Tissue iron content in three groups of specimens was determined by inductively coupled mass spectrum analyzer. Immunohistochemical staining was used to detect the expression and localization of the iron metabolism related protein oftransferrin receptor 1 （TfR1）， ferritin （FTL）， divalent metal transporter 1 （DMT1） and membrane iron transporter 1 （FPN1） in hypertrophic scars and its own normal skin specimens of the hypertrophic scar group. Results  There was no significant difference in iron content in normal skin tissue between the three groups （P>0.05）. The iron content in hypertrophic scar tissue in the hypertrophic scar group was higher than that in normal skin tissue （P<0.05）. Immunohistochemistry showed that iron metabolism related proteins were expressed in hypertrophic scar tissue and normal skin tissue of the hypertrophic scar group. Most of them were expressed in the cytoplasm. The expression was strong in the epidermis. The expression of DMT1 （±IRE）， FPN1 and FTL in hypertrophic scar tissue was higher than that in normal skin tissue （P<0.05）. The expression of TfR1 in hypertrophic scar tissue was decreased （P<0.05）. Conclusion  In hypertrophic scar patients， excessive iron deposition in scar area may lead to intracellular regulation of iron uptake and release through IRP/IRE system， and it is presumed that the role of TfR1 and FPN1 rather than DMT1 （±IRE） is mainly dependent on the role of TfR1 and FPN1.

Key words： hypertrophic scar; atrophic scar; transferrin receptor 1; ferritin; divalent metal transporter protein 1; ferroportin 1

增生性瘢痕是由创伤、手术等引起，是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为特征的病理性瘢痕。临床上增生性瘢痕是严重烧、创伤患者后期恢复所要面临的主要问题[1]。增生性瘢痕的预防和治疗是烧伤整形领域研究的热点和难点。已有学者证实微量元素不仅影响机体生长发育还可对组织增生修复产生一定作用，如Muri[2]在对瘢痕的研究中提出，病理性瘢痕的发生可能与瘢痕中缺乏某种物质有关;秦泽莲等[3]發现增生性瘢痕组织中微量元素含量较自身正常皮肤减少，认为微量元素的减少可能与增生性瘢痕的形成有关。但直到目前为止，其具体的发生机制仍不明确。本研究通过检测烧伤患者增生性瘢痕中的铁元素含量及铁代谢相关蛋白的表达状况，分析铁代谢相关蛋白表达的变化特点与增生性瘢痕形成的关系，旨在为临床治疗烧伤增生性瘢痕提供新的思路。

1  材料和方法

1.1 病例资料：组织标本均来自2016年-2018年石家庄市第一医院烧伤整形外科住院患者。患者分3组：正常皮肤组（A组）：取自外伤及美容手术受术者，取其正常皮肤标本，共15例;萎缩性瘢痕组（B组）：选取无任何症状，因单纯美容需求行瘢痕切除术的患者15例;增生性瘢痕组（C组）：选取具有增生性瘢痕典型症状体征的患者15例。患者均无职业性金属元素接触史和家族性瘢痕增生史;瘢痕患者术前未曾采用任何防治瘢痕的药物及相关治疗;患者均签署知情同意书。术前采血，术中采集标本。

1.2 主要试剂：兔抗大鼠多克隆FPN1一抗、鼠抗人单克隆TfR1一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1+IRE一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1-IRE一抗、兔抗人多克隆β-actin一抗均为Alpha Diagnostic International，USA产品;HRP-藕联的山羊抗小鼠IgG单抗、HRP-藕联的山羊抗兔IgG单抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，其他试剂为国产分析纯产品。

1.3 标本采集及留存：萎缩性瘢痕组及增生性瘢痕组患者分别采集瘢痕及其自身正常皮肤标本，瘢痕分别取材于面颈部、肩背部、腋窝部及上肢;正常皮肤取自同一患者全厚皮片移植剩余部分，取材于上肢、腹部及下肢。每例标本取材后均立即分为两份，一份置于4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片;另一份立即放入液氮中冻存备用。

1.4 组织铁测定：皮肤和瘢痕组织充分解冻后用双蒸去离子水冲洗6次，自然干燥24h后称重。分别取样0.3g置于消化器中，加入纯硝酸2ml，70℃水浴中加热4h，待样品溶解后继续100℃水浴加热2～3h，使消化器中溶液体积保持0.5ml;加入高氯酸0.1ml，并置于70℃水浴中加热1～2h至溶液呈清亮;将溶液转移入定容管内，用双蒸去离子水分别定容5ml。应用电感耦合质谱分析仪测定定容液中Fe元素的含量。按以下公式计算样品中Fe含量（μg/g）：定溶液微量元素含量（μg/g）×定容液体积（5ml）/样品重量（g）[4]。

1.5 免疫组织化学染色：免疫组化按SP免疫组化试剂盒说明书进行操作，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。TfR1鼠抗人单克隆抗体稀释度为1：100，DMT1+IRE、FPN1、FTL兔抗人多克隆抗体稀释度为1：200。PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断阳性表达在细胞膜或胞浆内，呈棕黄色颗粒。染色强度半定量分析：0（无表达），1（弱表达，染色较浅），2（染色中等程度），3（染色较深）。免疫组化染色强度评估由两位病理医师独立完成。

1.6 统计学分析：采用Graphpad 5.0统计学处理软件进行分析，采用配对检验方法及非参数单因素AVONA分析，实验结果用（x?±s）表示。

2  结果

2.1 组织铁含量：正常皮肤组、萎缩性瘢痕组、增生性瘢痕组正常皮肤中组织铁含量（μg/g）分别为：49.65±6.12，48.36±2.94，47.92±4.21，组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见图1。萎缩性瘢痕组：萎缩性瘢痕与其自身正常皮肤中组织铁含量（μg/g）为：45.37±4.15，48.36±2.94，二者比较差异无统计学意义（P>0.05），见图2。增生性瘢痕组：增生性瘢痕与其自身正常皮肤中组织铁含量（μg/g）为：69.71±4.53，47.92±4.21，二者比较，瘢痕组织铁含量增高，差异具有统计学意义（P<0.01）。

2.2 免疫组化检测增生性瘢痕组织中铁代谢相关蛋白表达量的变化：在所有病例中增生性瘢痕组织较其正常皮肤组织中FTL、DMT1+IRE、DMT1-IRE、FPN1表达显著增高。增生性瘢痕及正常皮肤组织中表达较广泛，在表皮层表达相对较强，在真皮及皮下组织中表达较弱。FTL主要表达在胞浆中。DMT1+IRE、DMT1-IRE及FPN1主要表达在胞浆、胞膜中，胞核内表达相对较弱。而在所有病例中增生性瘢痕组织较其正常皮肤组织中TfR1表达显著降低。增生性瘢痕及正常皮肤组织的表皮层表达相对较强，真皮及皮下组织中表达相对较弱。TfR1在细胞中主要表达在胞浆中。

3  讨论

研究发现，在严重创伤尤其是中、重度烧伤后的早期，患者体内的微量元素含量往往有较大异常。另有研究发现增生性瘢痕组织中的钙、镁、锌、铁和铜含量较其自身正常皮肤的含量下降。其中铁是人体的必需微量元素，参与体内众多的生化反应，铁代谢紊乱可引起多种常见疾病[5-7]。铁作为维持机体生命活动和组织细胞新陈代谢的重要物质，直接或间接参与到创伤修复过程中的细胞免疫、伤口愈合及抗氧化反应等多个环节[8-9]，过多或不足都将会影响创面的愈合[10]。目前，已有的研究都集中于增生性瘢痕中各种微量元素较正常皮肤中的含量的变化的研究，而有关增生性瘢痕中铁代谢相关基因蛋白表达的变化鲜有研究，本实验就增生性瘢痕和铁代谢相关蛋白之间的联系作一探讨。

已知，细胞内铁水平能够直接通过铁调节蛋白 （iron regulatory protein，IRP）、铁反应元件 （iron resposive element，IRE） 调节铁代谢相关蛋白的表达[11]。铁代谢相关蛋白有：转铁蛋白受体1 （TfR1）、铁蛋白（Fn）、二价金属离子转运蛋白1（DMT1）、膜铁转运蛋白1（FPN1）等。正常生理情况下，当细胞内铁含量较高时，胞内铁可与IRP结合，从而抑制IRP与IRE结合的活性，这样IRP不能与DMT1和TfR1 3'端的IRE结合，失去对DMT1和TfR1 mRNA的保护作用，其mRNA被降解，阻止二者的转录，DMT1、TfR1蛋白表达水平下降，细胞从胞外摄入铁的能力随之下降;此时FPN1 5'IRE也不能与IRP结合，FPN1的翻译抑制被解除，FPN1大量表达，增加铁从细胞内向外的输出[4]。反之，当细胞内铁水平较低时，与IRP结合的铁和IRP分离，激活IRP与IRE结合活性，IRP即与DMT1和TfR1 3'端的IRE结合，保护DMT1和TfR1 mRNA，使其免被降解，DMT1、TfR1蛋白水平表达上升，从而增加细胞铁摄取，此时FPN1 5'IRE与IRP结合，抑制FPN1的翻译，FPN1表达随之下降，减少铁向细胞外的输出。铁代谢相关蛋白通过上述原理达到调节细胞内铁水平的作用[12]。

本实验结果显示增生性瘢痕组患者瘢痕局部组织铁含量升高明显，免疫组织化学染色发现铁蛋白FTL的表达量也上升，这二者都提示瘢痕局部铁元素可能沉积过多。在瘢痕异常增生情况下，成纤维细胞、胶原细胞等细胞通过IRP/IRE调节系统摄入了大量的铁，来满足瘢痕内各种细胞的生长增殖及抗氧化的需要;然而摄入的铁过多，使胞内铁过载，在IRP/IRE调节系统作用下，TfR1、DMT1（±IRE）表达量下降，从而减少细胞铁摄入;FPN1表达升高，进一步增加铁释放，以维持细胞内铁稳态。但实验中发现TfR1表达量下降，而DMT1（±IRE）表达却增高，FPN1表达升高，分析其原因可能是TfR1在皮肤组织中本底表达低[13]，TfR1由于细胞内铁的增加而表达进一步下降。另一方面，这还可能因增生性瘢痕中其他的二价金属离子Zn、Cu等的含量较低[2]，而DMT1（±IRE） 是细胞中主要的二价金属转运体，对这些微量元素亦有摄取作用，为维持这些元素的细胞内稳态，细胞会通过增加DMT1（±IRE）的表达尽量摄取所需要的Zn、Cu等。因此推测在皮肤组织中，通过胞内的IRP/IRE调节系统，铁的摄取释放在主要依赖于TfR1以及FPN1的作用而非DMT1（±IRE）。除此之外，也可能还有其他的未知调节因素在铁代谢相关蛋白的表达过程中起作用，且作用大于IRP/IRE调节系统。

综上所述，本研究通过免疫组织化学的方法研究了铁代谢相关蛋白TfR1、DMT1（±IRE）、FPN1以及FTL在烧伤后增生性瘢痕组织及正常皮肤组织中的表达情况，结果表明，DMT1（±IRE）、FPN1及FTL在增生性瘢痕组织中高表达，TfR1表达量却下降。通过本研究，初步证实铁代谢相关蛋白各自在增生性瘢痕组织中的表达情况，为进一步从细胞分子水平理解认识增生性瘢痕的发生发展提供了新方向，将为增生性瘢痕的治疗提供新的途径、新的靶点的理论依据。本研究仅初步探讨了铁代谢相关蛋白在增生性瘢痕组织中的表达情况，样本量较少，仍需增加样本量对上述结论进行验证。

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[收稿日期]2019-04-27

本文引用格式：李冬軍，赵连魁，李明，等.铁代谢相关蛋白在烧伤后增生性瘢痕中的表达[J].中国美容医学，2019，28（12）：79-82.