小秦艽花质量分析研究

孟庆庆，特布新，奥·乌力吉，2*

(1.内蒙古蒙医药工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000)

小秦艽花，蒙古文名音译“呼和-朱力根-其木格”[1]“帮占-奥恩布”[2]，为龙胆科植物小秦艽(GentianadahuricaFisch.)的干燥花，常于夏、秋二季花开放时采收，除去杂质，及时干燥。小秦艽花具有清热解毒、止咳祛痰的功效，生于草原、山地、草甸、灌丛，分布于我国内蒙古、陕西、甘肃、新疆等地[3]。该药材较早收载于《无误蒙药鉴》《认药白晶鉴》等经典蒙医药著作[4-5]中，现有标准《内蒙古蒙药材标准》(1986版)除就其【性状】做了规定外，【鉴别】项下仅有粉末显微鉴别法；1998年升级载入《中国卫生部药品标准·蒙药分册》，【鉴别】项下增加了黄酮类化合物的一般理化鉴别法，无检查和含量测定项。因此，提升小秦艽花质量控制方法，确保蒙医临床用药的安全性意义重大。本文建立了小秦艽花的薄层鉴别和含量测定方法，并对小秦艽花进行了水分、灰分、酸不溶性灰分和浸出物等的测定，所建立的方法快速简便，准确可靠，可行性高，为其质量标准的提升提供了依据。

1 实验材料

1.1 药材

7批样品经内蒙古自治区食品药品检验所原蒙药室主任康双龙，内蒙古农业大学林学院教授额日敦·嘎日迪，内蒙古民族大学蒙医药学院教授布和巴特尔，内蒙古民族大学蒙医药学院教授吴香杰，内蒙古蒙医药工程技术研究院特聘专家白明刚，通辽市食品药品检验所中蒙药室主任安文远鉴定，均为GentianadahuricaFisch.的干燥花。样品采集信息见表1。

表1 小秦艽花样品采集信息

1.2 仪器

Alliance e2695高效液相色谱仪(Waters)；Mettler Toledo NewClassic MS105电子天平 d=0.01 mg[梅特勒-托利多仪器(上海)]有限公司；娃哈哈饮用纯净水(山东省济南市)；KQ-600DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BS224S电子天平(北京赛多利斯科学仪器系统有限公司)；SQP电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.3 试药

异荭草苷对照品(含量测定用，批号111974-201401，中国食品药品检定研究院)；聚酰胺薄膜(薄层层析用，天津思利达科技有限公司)；甲醇为色谱级(天津星马克科技发展有限公司)；水为娃哈哈饮用纯净水；磷酸、甲醇、乙醇等所用试剂均为分析纯(天津市永大化学试剂有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 供试品溶液制备 取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液制备 取异荭草苷对照品，加甲醇制成每l mL含0.3 mg异荭草苷的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 薄层色谱鉴别 按照《中国药典》(2015年版四部通则0502)薄层色谱法试验[6]，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以展开剂：①甲醇-水-冰醋酸(6∶1∶1，使用量×2=16 mL)；②乙醇-水-冰醋酸(4∶1∶1，使用量×2=12 mL)；③丙酮-水-冰醋酸(3∶1∶1，使用量×3=15 mL)，将不同产地7批次小秦艽花供试品溶液进行展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝试液，置于紫外光灯(254 nm)下检视。结果三个展开系统的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点；斑点Rf值适宜，显色清晰，色谱分离好。尤以展开剂甲醇-水-冰醋酸(6∶1∶1)更佳，且信息量多，故用于耐用性考察。结果见图1。

2.1.4 耐用性考察 吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，展开条件为A.室温展开(T=25 ℃，RH=5%)；B.冰箱冷藏室展开(T=5 ℃)；C.点样板RH75%(氯化钠过饱和溶液控制)预平衡30 min后，室温展开；D.点样板RH20%(醋酸钾过饱和溶液控制)预平衡30 min后，室温展开，按上述方法显色检视。结果见图2。

A.甲醇-水-冰醋酸(6∶ 1∶1)B.乙醇-水-冰醋酸(4∶ 1∶1)C.丙酮-水-冰醋酸(3∶1∶1)

A.室温展开(T25 ℃，RH5%)；B.冰箱冷藏室展开(T5℃)；C.点样板RH75%预平衡30 min后，室温展开；D.点样板RH20%预平衡30 min后，室温展开

2.2 检查

2.2.1 水分测定 按照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定法第二法[6]，对7批药材的水分进行考察。结果7批小秦艽花水分为4.64%～5.27%，平均值为4.93%。

2.2.2 灰分测定法、酸不溶性灰分 照《中国药典》2015年版四部(通则2302)灰分测定法[6]，对7批样品的总灰分及酸不溶性灰分进行了考察测定。结果7批小秦艽花总灰分为4.68%～9.64%，平均值为6.53%，酸不溶性灰分为0.70%～4.56%，平均值为2.16%。

2.2.3 重金属检查 对本品中的重金属含量进行了限量考察。参照有关文献(CHP2005I/阿胶)，取本品内容物1.00 g，按照《中国药典》2015年版四部(通则0821)重金属检查法第二法依法操作检查[6]。结果每批样品每1 g内容物中的重金属含量均少于10 μg，即均低于百万分之十。

2.2.4 砷盐检查 对本品中的砷盐含量进行了限量考察。参照有关文献(CHP2005I/阿胶)，取本品4.0 g，加无砷氢氧化钙2 g，混合，加少量水，搅匀，干燥后先用小火烧灼使碳化，再在500～600 ℃炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸4 mL与适量的水使溶解成50 mL，分取溶液12.5 mL，加盐酸4 mL与水11.5 mL，按照中国药典2015年版四部(通则0822)砷盐检查法第一法[6]，标准砷对照液的制备，自“再加碘化钾试液5mL”起，依法操作[8]。结果7批次供试品中，每1 g内容物中的砷盐含量均少于2 μg，即均低于2%。

2.3 浸出物

按照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部通则2201)项下的热浸法测定[6]，用75%乙醇做溶剂，结果7批小秦艽花浸出物为32.22%～40.85%，平均值为36.81%。

2.4 含量测定

按照高效液相色谱法(通则0512)测定[6]。

2.4.1 色谱条件 色谱柱为XSelect HSS T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为甲醇-0.04%磷酸溶液(33∶67)；检测波长为350 nm；流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.4.2 对照品溶液制备 取异荭草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含异荭草苷0.1604 mg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇10 mL，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 测定方法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱相应的位置有异荭草苷的吸收峰。结果见图1、图2。

图3 异荭草苷对照品HPLC色谱

图4 小秦艽花供试品HPLC色谱

2.4.5 线性关系考察 精密吸取浓度分别为0.032 08、0.064 16、0.096 24、0.128 32、0.160 4 mg/mL的异荭草苷对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积值。并以进样量C(x)对峰面积值A(y)进行线性回归，得标准曲线回归方程为：y=27 032 644.20x-21 098.74，相关系数r=1.00。结果异荭草苷进样量在0.320 8～1.604 μg范围内，与峰面积值具有良好的线性关系，相关性显著。

2.4.6 精密度试验 取同一浓度的异荭草苷对照品溶液，在24 h内重复进样6次，测定异荭草苷的峰面积，计算峰面积RSD为0.23%。结果表明日内精密度良好。

2.4.7 稳定性试验 分别于第0、2、4、8、12、24 h，精密吸取X4(批号20170828)供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积值。结果其RSD为0.87%。表明供试品溶液在24 h内测定稳定性良好。

2.4.8 重复性试验 精密称取样品X4(批号20170828)，按照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液6份，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积值，并计算含量。结果其RSD为1.61%。表明该方法具有良好的重复性。

2.4.9 加样回收率试验 取已知含量的样品X4(批号20170828；含量0.15%)约0.25 g，共9份，精密称定，分三组，按样品中含量-对照品加入量1∶0.5、1∶1、1∶1.5的要求分别依次精密加入异荭草苷对照品储备液(0.160 4 mg/mL)适量，按照“2.4.3”项下方法操作，制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

回收率试验结果符合药品质量标准分析方法验证指导原则(中国药典2015年版四部通则9101)[6]规定(待测定成分含量0.1%，回收率限度90%～108%)，表明本试验所采用的测定方法结果准确、可靠，可用于小秦艽花的含量测定。

2.4.10 不同产地样品含量测定 取小秦艽花样品约0.5 g，精密称定，分别按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，测定，并计算含量。结果见表3。

表3 不同产地样品含量测定结果

3 讨论

取异荭草苷对照品溶液，按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)，在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，结果在350 nm处有最大吸收，故测定波长确定为350 nm。

曾首选所含龙胆苦苷作为定量控制小秦艽花质量的特征指标成分，进行了高效液相色谱法测定其含量的研究[7]。结果因含量比异荭草苷低，故参考文献选择本品所含异荭草苷作为定量控制本品质量的特征指标成分，按照“中药质量标准分析方法验证指导原则”要求，进行了高效液相色谱法测定小秦艽花中异荭草苷含量的研究[8]。结果该方法简便、快捷、准确、重复性好。

溶剂浓度考察方面，样品取6份，依次加入60%～85%的甲醇溶剂，按提取方法处理，测定其含量。结果表明75%甲醇提取液含量较高，故提取溶剂乙醇浓度选定75%。

提取时间考察方面，取4份样品，精密加入溶剂，依次超声处理(功率500 W，频率4 0kHz)10 min、20 min、30 min、40 min(其余步骤按提取方法处理)，结果表明平均提取量为0.140 5%，RSD为1.88%，差异明显。故采用超声30 min提取。

色谱系统性试验考察方面，取已知含量的样品X4(批号20170806)约0.5 g，主要采用两种色谱柱XSelect HSS T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×25 0 mm)；测定小秦艽花中异荭草苷的含量，结果无显著性差异，RSD为1.79%、0.70%。

综上所述，该实验所采用的测定方法简便，结果准确、可靠，重复性好，可用于样品测定，为小秦艽花的研究提供了参考依据。