石斛合剂序贯法对糖尿病合并肝纤维化大鼠NF-κB信号表达的影响

张家林，林心君，周 勇，庄舒婷，施 红

(福建中医药大学 中西医结合学院，福建 福州 350121)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要特点为碳水化合物、脂类和蛋白质平衡失调，同时出现胰岛素分泌受损、胰岛素抵抗[1]。2型糖尿病是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的危险因素，该疾病包括肝脂肪变性(非酒精性脂肪肝，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化(HF)和肝硬化。许多前瞻性研究[2]表明，2型糖尿病和肝纤维化之间存在联系。糖尿病的主要表现为高血糖，且越来越多研究表明其能明显促进肝脏等器官纤维化的形成[3]。Ⅳ型胶原(ⅣC)与肝纤维化的程度关系密切，是构成基底膜的成分，反映基底膜胶原更新率，在肝纤维化时最早出现，可较灵敏地反映肝纤维化过程，因此可作为早期诊断的指标[4]。NF-κB是介导炎症的经典通路，而肝纤维化主要由于炎症介质激活肝形状细胞活化而形成。本文通过讨论石斛合剂对NF-κB信号通路的影响，以研究石斛合剂对2型糖尿病合并肝纤维化的抑制作用，为2型糖尿病合并肝纤维化的治疗提供新的理论依据。

石斛合剂(现为福建省第二人民医院院内制剂)序贯疗法是施红教授通过多年对糖尿病的临床与基础研究，不断实践与修正，总结出的独特配方，临床上常用于治疗糖尿病及其并发症。最新研究[5]表明，石斛合剂序贯法能够有效改善2型糖尿病合并肝纤维化大鼠血糖，肝功能(ALT、AST)，血清肝纤维化四项(PC-Ⅲ、HA、Ⅳ-C、LN)，然而石斛合剂对2型糖尿病合并肝纤维化的作用机制不明。本文通过观察2型糖尿病合并肝纤维化后的NF-κB信号表达，探讨糖尿病合并肝纤维化的部分机制及石斛合剂的治疗作用。

1 材料与试剂

1.1 动物

成年健康雄性SPF级Wistar大鼠40只，体重(200±10)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-00020，于福建中医药大学实验动物中心饲养。该实验符合中医药大学实验动物伦理委员会要求。采用随机数表法将40只Wistar大鼠随机分为正常对照组和模型组，模型组采用高脂高糖6W+STZ(25 mg/kg)造模，而后按照血糖、体重随机分为模型对照组、二甲双胍组、石斛合剂组，每组8只。

1.2 药材与试剂

石斛合剂1方：石斛、黄芪、丹参、五味子、知母、葛根、生地黄、地龙组成。石斛合剂2方：茵陈、栀子、滑石、大黄、萹蓄、甘草组成，购自福建中医药大学附属第三人民医院，加工成石斛合剂1方含生药量1.7 g/mL，石斛合剂2方含生药量1 g/mL，无菌保存于-20 ℃冰箱。一抗：兔抗大鼠IV型胶原抗体(购于Abcam，美国)、NF-κB P65(Cell Signaling Technology，美国)、NF-κB P50(Cell Signaling Technology，美国)、IκBβ(Cell Signaling Technology，美国)、IKKβ(Cell Signaling Technology，美国)、鼠抗β-actin抗体(Sigma，中国)、二抗：山羊抗兔、山羊抗鼠、链霉素抗生物蛋白-过氧化酶免疫组化试剂盒(购于碧云天生物技术研究所，中国)。

1.3 仪器

尼康生物显微镜(日本尼康公司，55I)；5417R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；电泳槽及转膜仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；DU-650型蛋白分析仪(美国Beckman公司)。

2 方法

2.1 模型建立

根据课题组前期造模方法[5]，高脂饲料配方：60.7%基础饲料、15%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉、4%胆固醇、0.3%胆酸盐，正常对照组予基础饲料喂养，余大鼠予高脂饲料喂养6周后。隔夜禁食(12 h)，予1%的STZ(柠檬酸钠缓冲液配制，pH=4.2～4.4)腹腔一次性注射(25 mg/kg)，续高脂饲料喂养。于注射后3天(72 h)后尾部采血测定血糖，若连续2次随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。按照体重、血糖分组后选取24只成模鼠，予40% CCL4(橄榄油配制)皮下注射(0.2 mL/100 g，2次/周，8周)，建立合并肝纤维化模型，并同时予相应药物处置(见“2.2”项)。

2.2 干预方法

石斛合剂组给予石斛合剂1方灌胃7天，给药剂量为17 g·kg-1·d-1，续给予石斛合剂2方灌胃3天，给药剂量10 g·kg-1·d-1，循环灌胃，干预8周；二甲双胍组给予二甲双胍灌胃，给药剂量为0.1 g·kg-1·d-1，干预8周；正常对照组、模型对照组给予等量0.9%NaCl溶液灌胃，干预8周。

2.3 取材

干预8周后，取材前隔夜禁食不禁水，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，剪开腹腔，腹主动脉采血，装于抗凝真空采血管，并4 ℃离心制备血清，用于生化指标检测。同时暴露肝脏，取出置于冰上，于预冷0.9%NaCl溶液中清洗，一部分0 ℃冰箱中保存行Western Blot检测，余肝脏组织，用滤纸吸净水分，置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫组化检测。

2.4 检测方法

2.4.1 血清学检测 尾部采血测量空腹血糖，离心制备的血清按试剂盒说明书测定AST、ALT。

2.4.2 免疫组化 肝脏组织石蜡切片(厚度4 μm)常规脱蜡、入水；PBS(磷酸盐缓冲液)清洗，将玻片置于枸橼酸盐缓冲液微波辐射修复，自然冷却到室温；PBS冲洗5 min×3次；加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min；PBS冲洗5 min×3次，加封闭血清，37 ℃恒温孵育1 h；甩去组织表面封闭液，滤纸吸去残留血清；滴加兔抗大鼠IV型胶原一抗(1∶200)，4 ℃过夜。第2日，室温复温30 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加羊抗兔二抗，37 ℃恒温箱孵育30 min；PBS冲洗5 min×3次，滴加链霉素抗生物蛋白-过氧化酶，37 ℃恒温箱孵育30 min；PBS冲洗5 min×3次，甩去PBS液，加2滴新鲜配制DAB染色液5 min，水洗，苏木素复染，水洗，吹干，封片。采用尼康生物显微镜观察。

2.4.3 Western blot检测 每100 mg肝脏组织加入1 mL细胞裂解液和10 μL苯甲基硫酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，充分研磨，12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测蛋白浓度。采用5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis，SDS-PAGE)，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入NF-κB P65(1∶ 1 000)、NF-κB P50(1∶1 500)、IκBβ(1∶1 000)、IKKβ(1∶1 000)及β-actin(1∶ 1 000)一抗，4 ℃过夜。TBST洗膜×3，加入二抗(1∶2 000辣根过氧化物标记)，室温孵育1 h，避光显影成像。采用Image-lab软件进行条带分析处理，以β-actin为内参。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠空腹血糖及血清肝功能指标比较

干预前，与正常对照组比较，模型对照组、二甲双胍组、石斛合剂组大鼠空腹血糖均明显升高(P<0.05)。干预后，与模型对照组比较，二甲双胍组、石斛合剂组大鼠空腹血糖明显降低(P<0.05)。与干预前比较，干预后二甲双胍组、石斛合剂组大鼠空腹血糖水平明显下降(P<0.05)。干预后，二甲双胍组与石斛合剂组大鼠空腹血糖水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，以上结果说明石斛合剂能有效降低2型糖尿病合并肝纤维化大鼠血糖。见表1。

与正常对照组比较，模型对照组大鼠ALT、AST显著升高，而二甲双胍组、石斛合剂组大鼠ALT、AST轻微升(P<0.05)。与模型对照组比较，二甲双胍组、石斛合剂组大鼠ALT、AST明显下降(P<0.05)，二甲双胍组与石斛合剂组大鼠AST比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示石斛合剂能有效改善2型糖尿病合并肝纤维化肝功能(ALT、AST)的情况。见表2。

组别例数(n)干预前(mmol/L)干预后(mmol/L)正常对照组84.7±0.275.32±0.25#模型对照组819.82±6.17*16.64±2.18*二甲双胍组820.94±5.38*6.7±2.63#△石斛合剂组819.36±6.74*7.55±2.71#△

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与干预前比较，△P<0.05。

组别例数(n)ALT(U/L)AST(U/L)正常对照组853.81±6.3176.44±6.25模型对照组8166.48±4.368*283.65±15.45*二甲双胍组898.44±12.95*#106.08±16.14*#石斛合剂组880.44±17.29*#106.71±15.81*#

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05。

3.2 肝组织Ⅳ型胶原(collagen-Ⅳ)免疫组化观察

肝脏Ⅳ型胶原阳性表达反应呈淡黄色，主要分布在肝细胞外间质，细胞核呈蓝染。正常对照组大鼠可见极少Ⅳ型胶原阳性表达沉积在细胞外间质，与正常对照组相比，模型对照组大鼠可见较多的Ⅳ型胶原阳性表达(P<0.05)。与模型对照组相比，二甲双胍组、石斛合剂组大鼠Ⅳ型胶原阳性表达显著减少(P<0.05)。见图1。

图1 肝脏免疫组化Ⅵ胶原表达情况

3.3 Western blot检测NF-κB P65、NF-κB P50、IKKβ、IκBβ蛋白表达

与正常对照组相比，模型对照组大鼠NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表达量显著升高，IκBβ表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比，二甲双胍组、石斛合剂组大鼠NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表达均显著降低，IκBβ表达量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，# P<0.05。

4 讨论

肝脏是胰岛素摄取和作用的器官，胰岛素能促进肝脏糖原的合成并减少糖异生，当胰岛素抵抗时，脂肪组织分解成游离脂肪酸增加，同时肝脏糖原合成及骨骼肌对血糖的摄取作用降低，最终不仅引发血糖升高甚至糖尿病，也会出现脂肪异位。许多研究表明，血糖升高及糖尿病会促进神经[6]、血管[7]、肾脏[8]纤维化及视网膜[9]发生病变。相关实验证实高糖会引起肝星状细胞活化增殖，促进肝纤维化[10]。

肝纤维化的特点为胶原纤维在肝细胞外间质过度沉积，而胶原纤维主要由肝星状细胞合成，高血糖被认为是一种炎症前状态，更容易激活肝星状细胞，合成胶原纤维[3]。在高糖状态下，许多炎症细胞因子大量产生，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1(IL-1)等，其能刺激肝星状细胞活化，导致肝纤维化发生。在长期的高糖状态下，蛋白质在体内容易反复糖基化，形成糖基化终末产物，从而与肝星状细胞表面糖基化终末产物受体结合产生信号传递，促进一系列与肝纤维化发生有关因子产生，如血小板衍生生长因子(PDGF)、TGF-β等[17]。

中药在治疗糖尿病及糖尿病肝纤维化方面具有独特的优势。许多现代研究表明石斛合剂中大部分药物的提取物除了有明显的降糖作用，还可改善肝脏炎性反应，防治肝纤维化。如石斛中的石斛多糖、黄芪中的黄芪总苷，均能提高大鼠抗氧化能力，减轻肝脏炎症反应[11-12]。五味子提取物可减轻肝细胞过氧化损伤，改善肝功能，抑制肝胶原纤维形成[13]。葛根中的葛根素可减少炎症因子的生成，缓解炎症因子对肝组织损伤，抗纤维化形成[14]。丹参中的丹参酮可改善肝功能、抑制星状细胞活化，减少细胞外基质生成[15]。地龙提取物、大黄中的大黄素可抑制肝组织形状细胞活化，发挥抗纤维化作用[16]。本研究证实石斛合剂具有降糖、改善肝功能及抗肝纤维化作用，石斛合剂干预6周后大鼠血糖及ALT、AST明显下降，通过电镜肝脏HE染色及免疫组化观察，可清晰观察到石斛合剂能抑制肝脏Ⅳ胶原纤维的合成及对肝纤维化明显的改善作用。

NF-κB是二聚体转录因子，其主要调节炎症相关功能。NF-κB通过入核与靶基因调节区中的κB序列结合而实现效用。哺乳动物的NF-κB二聚体通过2个Rel亚基的同源和异二聚体相互作用产生，分别由NF-κB1(编码p50及前体p105)、NF-κB2(编码P52及前体p100)、relA(编码P65)、relB(编码relB)及C-rel(编码c-rel)基因表达，P65和p50二聚体通常是基因转录的激活因子。

通常，NF-κB二聚体与IκB(IκBα，IκBβ，IκBε)蛋白结合而以无活性状态存在，其掩盖核定位和NF-κB二聚体的DNA结合结构域。在各种细胞炎症因子如TNF-α和IL家族等刺激下，NF-κB经典途径则被激活，从而导致P65和P50二聚体在核内堆积，IκB在丝氨酸32和36位处磷酸化，这过程由IKK复合物催化。该复合物含有两个催化亚基，IKKα和IKKβ及NF-κB调节亚基IKKγ，在经典途径中主要由IKKβ起作用。相关研究证实，NF-κB活化与肝星状细胞(HSC)转化成瘢痕形成的肝肌成纤维细胞有关，这也是纤维化反应的关键一步。本实验中，Wester blot检测显示石斛合剂能降低IKKβ、NF-κB P50、NF-κB P65蛋白表达，提示石斛合剂可降低NF-κB信号表达。因此石斛合剂的作用机制之一为减少IKKβ蛋白表达，从而降低其下游NF-κB P50、NF-κB P65蛋白的活化，抑制NF-κB信号途径，进而抑制肝脏胶原纤维的形成，改善肝纤维化，但是石斛合剂通过降低IKKβ信号抑制NF-κB信号通路的作用及其机制仍需进一步研究。