血管内皮生长因子基因表达对骨肉瘤的影响

闫加鹏 张洪飞 韩桂全

( 潍坊医学院附属医院关节外科 ， 山东 潍坊 261041 )

骨肉瘤来源于间叶组织，好发于长干骨如股骨远端、胫骨和肱骨的骨骺端。骨肉瘤多见于儿童和青少年，约有3 / 1000000的发病率[1]。骨肉瘤的发展是个复杂的、多步骤的、多因素参与的过程[2]，肿瘤干细胞及其潜在性导致了肿瘤的发生，这也提示遗传因素在骨肉瘤的发展过程中起着重要的作用[3-4]。研究证实，肿瘤的潜在侵袭性与血管内皮细胞中新生的血管有关[5-6]，血管内皮生长因子及新生血管的形成是肿瘤发生发展过程中的一个基本步骤[7]。血管内皮生长因子(VEGF)是一种强效的促血管生长因子，VEGF的多态性可以通过改变内部的转录和翻译来影响该基因的表达[8]，一些单核苷酸多态性比如-2578C/A、936C/T和460T/C被证实可以影响VEGF蛋白的合成。越来越多的研究证实VEGF多态性和肿瘤之间的关联性[9-11]，但目前只有2个研究报道了VEGF基因与骨肉瘤患病风险性之间的关联[12-13]。本研究旨在探索VEGF-2578C/A, +936C/T 和-460T/C基因多态性在骨肉瘤发生发展中表达水平的变化。现报告如下。

资料与方法

1 一般资料：本课题将潍坊医学院附属医院自2014年1月-2017年1月的90例骨肉瘤患者和90例年龄和性别无差异的健康对照组成员纳入本研究进行研究分析。所有的骨肉瘤患者都是初次患病，由2位病理学医生分别进行了确诊，从临床和病理两方面来获取骨肉瘤患者资料，其中包括性别、年龄、肿瘤分期、肿瘤部位、肿瘤转移和肿瘤家族史。对照组成员为我院健康体检的志愿者，均为非骨肉瘤患者，且自身没有任何癌症病史，无一级亲属骨肉瘤患病家族史。本研究方案经由潍坊医学院附属医院伦理委员会批准通过，根据赫尔辛基宣言对所有参与者签署书面知情同意书。

2 研究方法：用DNA提取试剂盒从外周血白细胞中提取DNA，PCR-RFLP法来研究VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C基因多态性表达差异。通过分子检测3.1软件来为VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C设计PCR引物。PCR反应的步骤如下：在Perkin-Elmer 9700的热循环仪里进行94°C下8分钟的初始变性，然后在94°C下 30秒内进行30个周期变性，在60°C退火30秒，在72°C 下进行1分钟延伸。PCR产物被NlaIII限制性内切酶(纽英伦公司，贝弗利，MA)进行酶解。由此产生的DNA片段，经3.5%琼脂糖凝胶下进行电泳，经过ethidum染色，在可视化的紫外线照射下透视。

3 统计学分析：使用SPSS 16版统计软件进行统计分析，连续变量之间的差异采用t检验评估，分类变量之间均采用皮尔逊x2检验来评估。对照组中VEGF-2578C/A,+936C/T 和 -460T/C基因多态性的哈代-温伯格均衡参数用皮尔逊x2检验。组间的基因型频率存在的差异则用皮尔逊x2检验手段、比值比(OR)和95%可信区间(CI)来评估。P值<0.05具有显著统计学差异。

4 结果：骨肉瘤患者和对照组的特性，见表1。观察组和对照组之间在年龄(P = 0.69)、性别(P = 1)、肿瘤家族史(P = 0.44)方面无统计学差异，其中骨肉瘤组平均年龄为(21.3±11.5)岁，对照组平均年龄为(21.2±11.9)岁。观察组中68.89%的骨肉瘤发生在长管状骨，其余31.11%位于躯干中轴骨骼；38.89%的骨肉瘤组患者出现肿瘤转移，其余的61.11%患者未发生转移。对照组的VEGF-2578C/A和460T/C基因频率在哈迪-温伯格平衡参数内，但936C/T基因型频率不在哈迪-温伯格平衡参数内，见表2。对照组中的VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C的次要等位基因频率(MAF)与中国大众人口NCBI数据库中的相一致。同-2578C/A的 CC基因亚型相比，-2578C/A 的AA基因型(OR = 1.90；95%可信区间 = 1.00-3.78)和CA+AA基因型(OR = 1.53；95%可信区间 = 1.00-2.25)在骨肉瘤风险中是显著增加的，见表3。+936C/T和-460T / C基因多态性与骨肉瘤风险之间的关联性并没有显著的意义。

表1 骨肉瘤患者和对照组的对比

表2 VEGF-2578C/A, +936C/T and -460T/C基因型

1MAF: 次要等位基因;2HWE: 哈迪-温伯格平衡参数。

表3 VEGF-2578C/A, +936C/T and -460T/C基因多态性与骨肉瘤风险性的关系

讨 论

遗传因素和某些导致DNA损伤与骨肉瘤的发生发展有关[14]，VEGF基因被认为是其中的一个重要遗传因素[12、13]。本研究旨在探索VEGF基因多态性与国人骨肉瘤风险之间的关联性，证实了-2578C/A的AA基因型和CA+AA基因型与骨肉瘤风险增加有关。新的血管生成在肿瘤的发生和转移过程中起着重要作用，而血管内皮生长因子是血管生成的关键因子，它能促进内皮细胞增殖和改变血管细胞外基质[15]。研究证实，在多种肿瘤中都有血管内皮生长因子的高度表达，并且它与促进肿瘤组织血管密度呈正相关[16]。血管内皮生长因子的基因多态性被证实与乳腺癌、肺癌、大肠癌、胃癌和前列腺癌等多种肿瘤的敏感性有关。目前仅有2个针对VEGF基因多态性与骨肉瘤风险性之间关联性的研究，Tie[12]将单核苷酸与骨肉瘤的患病率之间相关性进行了研究分析，证实了VEGF-2578C/A和-634G / C的多态性可能增加骨肉瘤患病率。Wang[13]等人发现VEGF基因中的3个常见单核苷酸多态性对于骨肉瘤的敏感性有着潜在影响，认为-634G/C 的T等位基因可能与中国人群的骨肉瘤多态性有关，但这都需要进一步的研究来证实。

本研究证实VEGF-2578C/A的AA和CA基因亚型可能增加了国人骨肉瘤的患病率，血管生长因子在骨肉瘤病因学中可能起着重要的作用。