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牛乳中头孢菌素类抗生素检测方法研究进展

2019-12-24李龙飞

乳业科学与技术 2019年5期
关键词:类抗生素头孢菌素牛乳

李龙飞

(威海职业学院康养学院,山东 威海 264210)

随着食品工业的快速发展和人民生活水平的不断提高,牛乳已成为越来越多消费者日常生活中的营养品。牛乳对于增强国民体质、改善青少年营养与健康具有重要意义,与之相应的是牛乳的安全性也必须得到高度重视。头孢菌素类抗生素是一类分子内含有β-内酰胺结构的半合成抗生素,具有抗菌谱广、杀菌力强、毒副作用小、过敏反应少的优点,在兽医临床和畜禽饲养中有广泛应用[1]。然而,在乳牛饲养过程中,滥用或不规范使用头孢菌素类药物的情况时有发生,而其导致的牛乳中头孢菌素类药物残留问题可能会对消费者健康造成危害,引发抗药或过敏风险。鉴于头孢菌素类抗生素的潜在风险,美国、日本、欧盟及国际食品法典委员会等都对牛乳中头孢菌素类抗生素残留制定了限量标准,其限量多为10~100 μg/kg[2]。我国农业部235号公告规定,牛乳中头孢喹肟、头孢氨苄、头孢噻呋等头孢菌素药物最高残留限量为20~100 μg/kg[3]。我国是乳制品消费大国,虽然人均消费量低于美国、日本等发达国家,但乳制品消费量连年持续增长,发展潜力巨大,因此发展快速可靠的牛乳中药物残留检测技术,确保消费者食品安全,对于保障乳品行业健康发展至关重要。

1 牛乳中头孢菌素类抗生素残留的潜在风险

由于头孢菌素类抗生素的高效实用性,在乳牛饲养过程中往往用其预防或治疗乳腺炎、肺炎、乳房细菌感染等疾病,以避免乳源产量和质量下降,给药方式多为饲喂或注射[4]。为防治乳牛疾病,大量或不规范使用头孢菌素类抗生素、不严格执行休药期规定等情况时有发生,导致原料乳中头孢菌素类药物残留超标,进而通过食物链传递累积,影响人类健康[5-6]。

牛乳中残留的头孢菌素类抗生素对人体的潜在危害主要有:1)引起过敏反应。长期摄入含头孢菌素类抗生素残留的牛乳可能破坏消费者肠道内的菌群平衡,引发皮疹、哮喘、荨麻疹等过敏反应[7];2)损伤肾脏。关于头孢菌素类抗生素对肾脏毒性的研究表明,头孢菌素类药物可能给肾脏带来损害[8];3)增强细菌耐药性。头孢菌素类抗生素残留可诱导人体产生耐药病源菌株,不利于消费者再使用抗生素治疗相关疾病[9]。

2 牛乳样品预处理方法

牛乳中含有蛋白质、脂类、乳糖及维生素等成分,在预处理阶段要尽可能除去干扰基质,纯化目标物。牛乳样品预处理的常用方法有液-液萃取法、固相萃取法和QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法等[10]。

2.1 液-液萃取法

液-液萃取是利用物质在不同溶剂(溶剂互不相溶)中溶解度或分配系数差异实现分离的方法[11],该方法易受实验人员操作手法和熟练程度等因素影响,净化提取效果不理想,有机溶剂消耗较大,应用范围较为有限[12]。Dasenaki等[13]采用液-液萃取法,先向牛乳样品中加入水(含0.1%甲酸、0.1%乙二胺四乙酸)、甲醇和乙腈体积比为1∶1∶1的混合液,通过漩涡振荡、超声提取、离心取上清液去除蛋白质,随后使用正己烷去除脂肪;采用超高效液相色谱(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)-串联四极杆飞行时间质谱法建立鱼类组织和牛乳中143 种兽药(含头孢菌素类药物)的筛查方法,牛乳中的检出水平为150 ng/mL。

2.2 固相萃取法

固相萃取是利用选择性固体吸附剂将目标物先从液体样品中分离,然后将其洗脱,以达到富集目标物和去除干扰基质的目的[14]。与液-液萃取相比,固相萃取能够更准确地将头孢菌素类药物残留与干扰基质分离,有效提高回收率,且有机溶剂消耗少,对环境相对友好,因此目前固相萃取法在头孢菌素类药物残留的预处理中应用最为普遍。莫楠等[15]以5%甲酸-乙腈溶液作为提取剂,待测头孢菌素类药物经Oasis PRIME HLB固相萃取柱分离纯化,氮吹复溶后注入UPLC-串联质谱(UPLC-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)仪,采用电喷雾离子源正离子模式及多反应监测模式进行检测,建立同时测定牛乳、乳粉、酸乳3 种乳制品中4 种头孢菌素类药物残留的方法,结果表明,牛乳和酸乳中头孢氨苄、头孢匹林、头孢洛宁和头孢喹肟的定量限为4 μg/kg,乳粉中为32 μg/kg;4 种头孢菌素类药物添加量为4~150 μg/kg时的回收率为63.3%~112.1%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.6%~10.5%;基质效应为108.77%~379.91%,方法检测周期短,适用于多种乳制品检测。

王建凤等[16]将样品用0.05 mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液提取,HLB固相萃取柱净化,UPLC-MS/MS测定,采用多反应监测模式进行定性和定量分析,建立同时测定牛乳中6 种头孢菌素类抗生素的方法,结果表明,6 种待测头孢菌素类抗生素的检出限为0.05~0.40 μg/kg,定量限为0.1~1.6 μg/kg,乳样加标回收率为66.3%~110.0%,方法高效、便捷,能够满足牛乳中头孢菌素类抗生素的检测。

除常规固相萃取外,一些新型固相萃取技术也应用于头孢菌素类抗生素残留检测中,如分子印迹固相萃取技术、磁性固相萃取技术等[17]。

Quesada-Molina等[18]通过非共价分子印迹法,以三丁基铵-头孢羟氨苄盐(three butyl ammonium-cefadroxil,TBA-CFD)作为模板,以甲基丙烯酸作为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂,在丙酮、甲醇体积比92∶8的混合液中制备头孢氨苄和头孢匹林的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP),将制备的MIP用于固相萃取和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC),检测头孢菌素类药物,结果表明,与非印迹聚合物相比,MIP对标准溶液及牛乳样品中的头孢氨苄、CFD和头孢匹林更具选择性,加标乳样中3 种目标分析物的回收率均高于60%。

Liu Xiaodan等[19]采用具有C18官能化内孔壁的磁芯孔壳微球作为固相萃取吸附剂,开发了一种快速、有效的提取方法,用于测定牛乳中头孢菌素(头孢唑啉、头孢氨苄、头孢哌酮)的残留量。该方法无需蛋白质沉淀过程,头孢菌素药物通过与中孔通道内壁功能化的C18基团的疏水作用,直接吸附在C18-Fe3O4@mSiO2微球上,而牛乳样品中丰富的蛋白质则由于尺寸排阻效应被排除在外。通过磁铁引入外加磁场,即可快速分离出吸附有头孢菌素药物的C18-Fe3O4@mSiO2微球,经甲醇洗脱后,洗脱液注入HPLC-MS/MS仪进行分析,3 种头孢菌素类抗生素的回收率为85%~115%,RSD为6.3%~10.8%,提取方法简便快速、稳定性好,适用于牛乳中头孢菌素类药物残留的测定,为简化和加快样品制备步骤提供了有益的替代方案。

2.3 QuEChERS法

QuEChERS法是一种基于分散固相萃取建立起来的简单、快速的样品制备技术,相比于液-液萃取法和固相萃取法,QuEChERS法具有操作简便、快速、准确、回收率高、有机试剂用量少等优点,除了应用于农药残留检测,近年来在兽药残留检测领域也有越来越多的应用[20]。张小刚等[21]将含有体积分数1%醋酸的乙腈加入牛乳样品中,用以提取头孢菌素类抗生素,氮吹浓缩、经C18吸附剂净化后,采用HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)分离,以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾离子源正离子模式下电离,多反应监测模式下检测,建立QuEChERS-UPLC-MS/MS法同时测定牛乳中6 种头孢菌素类抗生素的分析方法。结果表明,所建立方法的检出限为0.2~0.6 μg/kg,定量限为0.8~2.0 μg/kg,3 个加标量下6 种头孢菌素类抗生素的回收率为75.1%~94.4%,RSD为0.63%~8.30%,方法快速简便、准确度高,适用于牛乳中头孢菌素类抗生素残留的监测。

3 牛乳中头孢菌素类抗生素残留检测分析方法

当前针对牛乳中头孢菌素类抗生素残留的检测分析方法大致分为仪器检测法、免疫检测法及微生物检测法3 类[22]。其中仪器检测法应用最为广泛,免疫检测法次之,微生物检测法应用相对较少。

3.1 HPLC法

HPLC是一种利用不同组分在流动相和固定相中分配系数不同实现不同组分分离的技术,目前,HPLC在食品药品检测、化工原料检验及环境保护监测等领域均有广泛应用[23-24]。Karageorgou等[25]采用超声辅助基质固相分散法从牛乳中分离出8 种头孢菌素(CFD、头孢克洛、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢哌酮和头孢噻呋),通过HPLC进行多残留物检测及分析,结果表明,8 种头孢菌素类抗生素的回收率为93.4%~115.3%,RSD小于15.3%。

3.2 HPLC-MS/MS法

HPLC-MS/MS是一种建立在物质离子化基础上通过荷质比分离离子的检测分析技术,虽然仪器价格昂贵,但检出限低于HPLC,能够更好地满足牛乳中微量头孢菌素类抗生素残留的检测需求[26-27]。

周昱等[28]使用乙腈提取牛乳样品,离心后将上清液加入乙腈饱和的正己烷,振荡,取乙腈层进行检测分析,以ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)为分析柱,以乙腈和5 mmol/L乙酸铵为流动相,采用电喷雾离子源负离子模式进行电离,多反应监测模式进行检测,建立牛乳中头孢尼西的HPLC-MS/MS快速测定方法,方法的检出限为0.04 μg/L,定量限为0.15 μg/L,样品3 个加标水平下的回收率为87.4%~93.5%,RSD为2.1%~4.5%。

3.3 UPLC-MS/MS法

UPLC是基于HPLC理论,采用更小的色谱柱填料粒径和极低系统体积,极大提高了分析效率[29]。目前,UPLC-MS/MS已广泛应用于兽药的多残留筛查,与HPLC相比,UPLC可以更加准确地定性与定量复杂混合物中的组分[30]。王晓燕[31]采用乙腈-水提取乳粉样品,用正己烷除脂,提取液经HLB固相萃取净化,进行UPLC-MS/MS检测,建立乳粉中头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢匹罗及头孢洛宁残留的快速检测方法,结果表明,7 种头孢菌素类抗生素残留的检出限为10~20 μg/kg,定量限为20~40 μg/kg,加标回收率为62%~90%,RSD为3%~11%,方法测定准确度高,适用于乳粉中7 种头孢菌素类药物残留的检测。

3.4 免疫检测法

常见的免疫检测法有放射免疫标记法和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法等,其中ELISA是当前牛乳检测中使用最为广泛、较为快速、灵敏的一种检测方法[32-33]。与常规理化分析手段相比,免疫检测法具有更高的特异性和灵敏度,但易出现假阳性结果限制了其应用[10]。卞素敏等[34]应用头孢氨苄单克隆抗体,建立牛乳中头孢氨苄残留的间接ELISA检测方法,线性检测范围为1.0~50.0 μg/L,检出限为1.0 μg/L,半抑制质量浓度为4.1 μg/L,牛乳样品3 个加标量下的回收率为93.3%~98.2%,头孢氨苄抗体与头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克洛及头孢克肟的交叉反应率分别为160.0%、80.0%、28.4%和3.7%,方法简单、有效、精确度及准确度较高。

3.5 微生物检测法

微生物检测法经济、简单,但由于其检出限一般高于欧盟药典规定的最大残留量,限制了其进一步应用,目前微生物检测法在头孢菌素类抗生素残留检测领域的研究较少[22]。

李延华等[35]采用3 种微生物检测法(氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)法、嗜热脂肪芽孢杆菌纸片(Bacillus stearophilusdisk,BSDA)法、试管扩散法)对牛乳中6 种β-内酰胺类抗生素残留进行检测,确定了3 种方法对牛乳中常见β-内酰胺类抗生素残留的检出限、检测时间、操作难易等参数。结果表明:BSDA法操作繁琐、检测时间长、效率较低;TTC法检出限较高,不符合测定标准;试管扩散法在操作流程、检测时间及检出限等方面均优于另外2 种微生物法,具有一定的应用价值。

4 结 语

近年来,国内外食品安全事件频发,牛乳作为人们日常膳食的重要组成部分,确保其安全的重要性不言而喻。目前,针对牛乳中头孢菌素类药物残留的检测中,预处理方法多以固相萃取为主,检测技术则以LC-MS/MS为首选。对于牛乳中头孢菌素类药物残留的研究主要集中在通过仪器分析建立高通量的检测方法,如飞行时间质谱、轨道阱串联质谱等高分辨率技术,但大型精密仪器的购置、分析检测及维护保养成本均较高,且高通量容易带来特异性低等问题。因此,在保持高通量筛选的基础上,开发特异性强的新型免疫分析检测技术或成本低廉、操作简便的小型便携式检测设备成为接下来的研究重点。随着学科交叉相融和新技术的不断出现,联合研制出快速、准确、特异性强、灵敏度高、费用低、环境友好的药物残留监测和现场检测技术将成为可能。

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