猪脾转移因子注射液热原检查研究

徐 磊 朱晓玮 周永银 许秀梅 杜 君 刘小龙 赖隆永 林祚贵 黄 瑜

（1.福建农业职业技术学院 福州 350119；2.南京天邦生物科技有限公司 南京 211102；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013）

转移因子（Transfer Factor，TF）是白细胞中具有免疫活性的T淋巴细胞所释放的一类可透析小分子物质，属于多肽类物质，其肽分子比蛋白质小很多，具有效果显著、作用迅速、无抗原性、使用安全、无毒副作用、无药物残留等优点[1-3]，被广泛运用于人类和兽医临床领域，具有十分重要的理论研究和应用价值[4-11]。热原是微生物的代谢产物，是可引起人、猪、鸡等恒温动物体温异常升高的致热物质[12]。热原检查法作为检查热原的一种基准方法，系将一定剂量的待检样品经静脉注入兔体后，观察家兔体温的升高情况，以判定待检样品所含热原限度是否符合规定，半个多世纪以来一直被广泛用于药品和生物制品的热原检查，为医药安全作出了巨大贡献[13-14]。

为了建立TF的热原检查方法及对其制造工艺进行验证，本试验按照课题组已授权国家发明专利制备3批TF[15-17]，通过热原检查法对3批TF进行热原检查研究，以期明确发明专利制造工艺对热原的去除效果，为兽用TF的规模化制备提供相关试验参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物 家兔购自福建省连江刘氏兔业养殖场，经检验符合现行《中国兽药典》附录“热原检查法”供试用家兔要求，即试验用家兔体重1.7 kg以上，健康合格，雌兔无孕。试验前7 d，体重无减轻，食欲、排泄、精神等无异常现象。

1.2 TF制备 参照本课题组已授权的国家发明专利制备3批TF[15-17]：以健康猪脾脏为原料，经匀浆、细胞破碎、灭活、微滤、超滤后精制而成，3批TF分别为TF-1、TF-2、TF-3。 经检验，所制备 3批TF的pH值分别为6.88、6.92和6.96，多肽含量分别为2.92 mg/mL、2.68 mg/mL 和 2.60 mg/mL，核糖含量分别为 59.8 μg/mL、58.4 μg/mL 和 56.3 μg/mL，脱 E 受体法效力分别为15.7%、15.4%和17.1%，细菌内毒素含量均不超过10 EU/mL，在250～260 nm处有最大吸收峰（均为253 nm），OD260nm/OD280nm的比值均大于 1.9（分别为 2.29、2.30和 2.32），外源病毒检验、支原体检验、无菌检验、蛋白质定性检验、过敏反应检查、异常毒性检查、安全检验均合格。

1.3 试验设计 取家兔9只，随机分成3组：第1组、第2组和第3组，每组3只家兔，分别编号1～9。选取TF-1、TF-2和TF-3作为待检样品，分别以0.5 mL/kg剂量经耳静脉缓缓注入第1组、第2组和第3组家兔，开展热原检查试验，试验设计见表1。

表1 热原检查试验设计

1.4 热原检查试验

1.4.1 试验前准备 与待检样品接触的试验用器皿为无菌、无热原器皿。在开始热原检查试验前1 d，家兔处于同一温度的环境中，饲养室和实验室的温度相差不大于3℃，且控制在17～25℃，在试验过程中，实验室温度变化不大于3℃，并防止动物骚动及避免噪声干扰。家兔在试验前2 h停止给食，并置于宽松适宜的装置中至试验完毕。肛温计（精密度为±0.1℃）插入肛门的深度及时间各兔均一致，其中，深度约6 cm，时间2 min，每隔30 min测量体温1次，共测量2次，两次体温之差不高于0.2℃，两次体温平均值作为该兔的正常体温。且正常体温在38～39.6℃范围，同组各兔间的正常体温之差不高于1℃。

1.4.2 检查法 在测定家兔正常体温后15 min内，经耳静脉缓缓注入0.5 mL/kg剂量并温热至约38℃的待检样品，然后每隔30 min测量1次，共测量6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度 （当家兔升温为负值时以0℃计）。如果3只家兔中有1只体温升高不低于0.6℃，或3只家兔体温升高的总和不低于1.3℃，应另取5只家兔进行重检，检查方法同上。

1.4.3 结果判断 在首免的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔的体温升高总和低于1.3℃；或在重检的5只家兔中，体温升高不低于0.6℃的家兔不超过1只，并且首免、重检合并8只家兔的体温升高总和不高于3.5℃，均判定待检样品的热原检查结果符合规定。

在首免的3只家兔中，体温升高不低于0.6℃的家兔超过1只；或在重检的5只家兔中，体温升高不低于0.6℃的家兔超过1只；或在首免、重检合并8只家兔的体温升高总和高于3.5℃，均判定待检样品的热原检查结果不符合规定。

2 结 果

按试验方法进行操作，测得各家兔正常体温和升高体温，结果见表2。结果显示，待检样品注射后各家兔的体温升高值均小于0.6℃，且各组的3只家兔体温升高值总和均小于1.3℃。因此，判定3批TF的热原检查结果均符合现行《中国兽药典》规定。

表2 热原检查结果

3 讨 论

在医学发展史上，注射给药方式的创立是一个重大的进步，其在人类与疾病斗争过程中发挥着重要作用。但是至今，临床上常因输注药液而引起机体出汗、高热、呕吐、昏迷甚至危及生命，被称为热原反应[18]。

热原是能引起恒温动物体温异常升高的致热物质，其在机体作用于体温调节中枢，使机体散热减少、产热增加，表现出体温上升等热原反应。细菌内毒素脂多糖被认为是最主要的热原，所有已知的细菌内毒素脂多糖均具有很强的热原活性。当前，常用的热原检测方法主要有细菌内毒素检测法（鲎试剂）和家兔法。其中，家兔热原检测法的优点是能够反映热原所引起哺乳动物复杂的升温过程，该方法不仅可检测出细菌内毒素的致热原，而且能检查出非细菌内毒素的致热原，适用于较多种类的热原物质检查[19-20]。

自20世纪50年代发现TF至今，TF作为具有非特异性活性和特异性免疫活性的细胞调节因子，国内外学者对其开展了大量研究[21-27]。本试验按照现行《中国兽药典》附录“热原检查法”，对本课题组已授权国家发明专利所制备的3批TF开展热原检查研究，结果显示，3批TF的热原检查结果均符合现行《中国兽药典》规定，表明本发明专利制造工艺可有效去除热原，保证TF制品的安全性。