猪Toll样受体研究进展

李 鹏 王雅春

（1.中国农业大学动物科技学院 北京 100193；2.福建顺鑫鑫源食品有限公司 福建南平 354004）

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是生物进化过程中较为保守的I型跨膜蛋白，也是目前在哺乳动物中研究最多的模式识别受体，可识别细菌或病毒 的多种抗原成分，如鞭毛蛋白、脂多糖、病毒RNA等[1-3]。

TLRs作为重要的模式识别受体，一直受到研究者们的重视，随着对猪TLRs研究的深入，很多病原的致病机制、益生菌保护作用的分子基础得到了合理的解释。另外，猪的TLRs基因中普遍存在非同义单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP），并且主要集中在胞外编码区，这在疫苗设计上的应用也具有重要意义[4]。

1 猪TLRs组织和细胞分布

目前，在哺乳动物细胞中发现了13种TLRs，其中10种在猪细胞上得到了克隆（TLR1-10）。根据TLRs在猪体内细胞上的分布及其接头分子的种类，猪TLRs可分为两大类：第一类表达于细胞表面，主要识别微生物或其特定成分，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR10[4]；第二类分布在细胞器膜表面，主要识别核酸及其衍生物，包括TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9[5-6]。

在不同组织或细胞上TLRs的表达水平具有明显差异[7-8]，免疫相关的组织或细胞上的表达水平相对较高，如脾脏、肠系膜淋巴结以及与外界环境接触的肠和气管等粘膜组织[9]。在猪生殖系统中不同器官TLRs的表达水平也明显不同，如TLR3和TLR5在猪睾丸、附睾、卵巢和输卵管中表达水平较高，而TLR9的表达水平较低，在胚胎中TLR1表达水平较高[10]。另外，TLRs在细胞上的表达水平还与猪的品种、生长日龄及饲料种类有关，如大多数TLRs在藏猪细胞上的表达量显著多于约克夏猪，且随着猪日龄的增长其表达量也随之增加[11]；成年猪肠系膜淋巴结TLR1和TLR6、胃TLR3的表达量显著高于新生仔猪；在12周龄的猪体内，约克夏猪和藏猪脾脏、血液、胸腺的TLR5及其脾脏的TLR6、TLR7，约克夏猪脾脏的TLR3、TLR4，藏猪扁桃体的TLR9均具有较高的表达水平[11]；芦荟多糖可以提高猪肝脏和脾中TLR2和TLR4的表达水平，这有助于提高断奶仔猪的免疫功能[12]。这些TLRs表达差异可能与猪的抗病能力密切相关。

2 猪TLRs的进化分析

通过物种间进化分析发现，哺乳动物TLRs可大致分为6组，且猪与人的TLRs进化关系比较接近，见图 1。 TLR1、TLR2 和 TLR6（也包含 TLR10，但其配体尚不明确）为一组，主要识别革兰氏阳性菌的复合物，TLR1、TLR6和 TLR10与TLR2来源于同一分支[13]，而 TLR1、TLR6（可能包含 TLR10）与 TLR2形成二聚体发挥作用[14-15]。与其它TLRs相比，TLR3、TLR4、TLR5在进化上比较特殊，分别各为一组，TLR4主要识别革兰氏阴性菌的脂多糖成分，TLR3、TLR5分别识别不同病毒或细菌的抗原组分[16]。TLR7、TLR8和TLR9分为一组，主要分布在宿主细胞的细胞器膜上，在病毒成分的识别上发挥主要作用。鼠TLR11、TLR12和TLR13在人和偶蹄兽动物中还没有发现，其中TLR11主要识别非病原菌，TLR12和TLR13还没找到相应的配体[17]。

3 猪TLRs各家族成员研究现状

图1 哺乳动物TLRs进化树

入侵的细菌、病毒等微生物或其特定成分被TLRs识别后，TLRs下游信号通路将被激活，进而上调促炎细胞因子或干扰素的表达[4]（见图2）。髓样分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）是TLR信号通路中一个重要的接头分子，根据TLR信号通路对MyD88的依赖性，TLRs信号通路分为两种：MyD88-dependent和 MyD88-independent signaling pathways，在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要的作用[13]。

3.1 TLR1、TLR2和TLR6 它们在进化关系上比较接近，且TLR2与TLR1或TLR6形成异质二聚体发挥功能，参与识别多种抗原分子，如革兰氏阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸、分枝杆菌的脂阿拉伯甘露糖、锥形虫的糖基磷脂酰肌醇以及酵母或其它真菌的酵母多糖[18]。有研究表明受体和配体的相互作用能有效促进抗原递呈细胞识别抗原的能力，进而促进细胞的吞噬及下游信号通路过程，猪TLR2就发挥这种受体功能，可高效促进猪抗原递呈细胞识别并吞噬詹氏乳酸杆菌[19]。抗体封闭猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages，PAMs）TLR2 和 TLR6可显著降低猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）诱导的TNF-α的表达水平，说明猪 TLR2和TLR6在宿主识别和抵御M.hyopneumoniae感染中起重要作用。真菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）可破坏肠上皮细胞的屏障保护功能，可能还与肠道炎症有关，而猪肠上皮细胞的TLR2相关信号通路可抑制DON对肠道粘膜屏障的破坏[20]。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）CRL1505可以通过TLR2信号通路提高Th1型免疫反应，上调猪肠上皮细胞IL-6和TNF-α的表达[21]。

3.2 TLR4 TLR4在猪各种组织中广泛存在，主要识别革兰氏阳性菌的LPS或脂质A，可诱导产生多种促炎细胞因子的分泌，在抵抗革兰氏阳性菌的感染上发挥重要作用，然而LSP过度上调促炎因子的表达可能会导致严重的炎症反应。用LPS刺激猪小肠上皮细胞可显著上调TLR4和炎性因子TNF-α、IL-1β的表达，说明在猪体内TLR4及其相关信号通路参与了LPS引起的炎症反应[22]。嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）是一种非常重要的益生菌，可调节肠道菌群平衡，有效抑制肠道不良微生物的繁殖，研究发现L.acidophilus可通过TLR4/NF-κB信号通路降低猪外周血淋巴细胞促炎细胞因子的表达水平缓解LPS引起的炎症反应，进而增加猪日进食量和日增重[23]。另外，猪TLR4可能还在抗病毒感染中起作用，如圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）可上调TLR4的表达水平，进而激活下游信号通路，上调相关抗病毒细胞因子的表达[24]。

3.3 TLR5 TLR5特异地识别细菌的鞭毛蛋白，被激活后可诱导下游复杂的级联反应，通过NF-κB信号通路，上调促炎细胞因子及趋化因子的表达。通过单核苷酸多态性分析发现民猪（Min pig）TLR5含有4个非同义单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点，分别为 c.176C＞T（p.R59M）、c.902C＞T（p.S301F）、c.959T＞A（p.F320Y）和 c.1796C＞T（p.T599M，reference sequence:GenBank No.AB208697），其中 SNP c.1796C＞T（p.T599M）位于TLR5胞外区的一个N端糖基化位点编码区域，猪TLR5 SNPs可能与细胞识别细菌鞭毛蛋白的能力密切相关[25]。

图2 TLRs诱导的不同信号通路示意图

3.4 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9TLR3、TLR7、TLR8和TLR9分布在细胞器膜表面，主要通过上调抗病毒细胞因子I型干扰素（IFN-α/β）的表达发挥抗病毒作用。TLR3可识别病毒双链RNA，在PAMs中TLR3在识别病毒RNA上起着重要作用；TLR7和TLR8识别单链RNA；TLR9识别非甲基化CpG DNA，这种核酸基序一般存在于细菌的基因组DNA中，也存在于病毒基因组中，如单纯疱疹病毒2型[26]。病毒核酸被相应的TLRs识别后，下游的转录因子（包括IRF1、IRF3和IRF7）被激活，从而上调IFN-α/β的表达水平。如 H3N2猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）可 显 著 提 高 PAMs 中TLR3、TLR7 的表达，进而上调 IFN-α 的表达[27]；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）可显著上调TLR3、TLR7和TLR8的表达，进一步诱导 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 的分泌[28]。氧化剂和抗氧化剂可有效干预PRRSV对TLR3/NF-κB信号通路的激活，提示该信号通路的激活可能是通过细胞的氧化应激机制调节的[29]。然而目前很多研究表明PRRSV感染可下调宿主细胞IFN-α/β的表达，其分子机制也得到初步研究：PRRSV可阻止双链RNA或仙台病毒诱导的IRF3磷酸化及核转位过程[30]，与PCV2联合感染可抑制TLR3、 TLR7 和 TLR9 的表达[31]，进而抑制 IFN-α/β的表达。在肾脏的冷藏过程中，caspase-3小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）灌注肾动脉可有效保存肾脏的活性，然而将此方法用于处理猪自体移植肾脏时，肾脏出现严重的炎症反应和细胞凋亡，不能起到很好的保存效果，通过western blotting和quantitative PCR检测发现，caspase-3 siRNA可上调猪自体移植肾脏TLR3、TLR7及其接头分子TRIF和MyD88的表达水平，进而上调促炎细胞因子 IL-1、IL-6、TNF-α 和 IFN-α/β 的表达[32]。

4 总结与展望

TLRs是宿主识别入侵病原微生物的重要模式识别受体，同时也与自身免疫反应的调节及自身免疫病密切相关。因此，需要更加深入地了解TLRs在细胞内发挥的作用，以TLRs为靶标探索解决机体免疫失衡的方法。目前在药物或病理研究方面，活体动物模型主要以小鼠为主[33]，但是鼠和人的TLRs在功能上还存在较大的差异，比如用脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）处理小鼠和人的星状胶质细胞，其TLR4发挥着不同的功能[34]，这说明小鼠动物模型在人TLRs研究方面不能提供充分的数据。然而有证据显示猪的TLRs在功能上与人更接近[35]，越来越多的研究发现在人的某些传染病和自然免疫病方面，猪可以作为较好的动物模型。因此，对猪TLRs深入系统地研究可为养猪业的健康发展和人类疾病研究提供重要参考。