lncRNA ATB 在食管鳞状细胞癌中的表达及对预后的影响

徐赟，郭锰，张成辉

南阳市中心医院肿瘤科，河南 南阳 473000

食管癌为消化道恶性肿瘤，在中国发病率居恶性肿瘤第5位，病死率居第4位[1]。食管鳞状细胞癌为食管癌的常见亚型，多数的食管鳞状细胞癌患者发现时已出现晚期转移，导致5年生存率极低[2-3]。因此若能及早了解患者预后情况，给予针对性的干预对降低死亡事件的发生具有重要意义。但目前缺少灵敏度、准确度均较高的生物学标志物评估预后情况。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一组长度大于200 bp的RNA，在多种生物学过程中发挥重要作用[4-6]。被转化生长因子β活化长链非编码RNA（long non coding RNA activated by transforming growth factor-β，LncRNA ATB）为lncRNA家族的一员，有报道指出，其在乳腺癌及结直肠癌中表达异常，并与患者预后关系密切[7-8]。但lncRNA ATB在食管鳞状细胞癌中的表达情况及是否与患者预后存在联系未见报道。因此本研究采用实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测食管鳞状细胞癌患者中lncRNA ATB的相对表达量，分析其与患者预后的关系，以期为临床评估食管鳞状细胞癌患者预后提供参考，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2012年1月至2016年1月南阳市中心医院收治的95例食管鳞状细胞癌患者为研究对象。纳入标准：①均经病理活检确诊为食管鳞状细胞癌；②均行手术切除；③均为初治，无家族遗传史；④预期生存时间≥5个月。排除标准：①入组前接受放化疗等及其他针对性治疗；②合并其他部位恶性肿瘤；③合并严重心肝肾功能不全；④术前合并感染性疾病；⑤存在手术禁忌证；⑥对治疗药物存在过敏反应；⑦伴有远处转移；⑧随访失联。95例食管鳞状细胞癌患者中男性67例，女性28例；平均年龄（63.72±7.04）岁；体重指数（22.04±3.42）kg/m2。取95例食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织（距肿瘤＞1 cm）进行研究。本研究经医院医学伦理委员会批准，且所有患者均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

采用qRT-PCR法检测食管鳞状细胞癌组织和癌旁细胞中lncRNA ATB的相对表达量，采用Trizol试剂提取食管鳞状细胞癌组织和癌旁细胞中的总RNA，在20 μl体系中加入2 μg总RNA合成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix进行qRTPCR，以cDNA为模板，引物浓度为0.4 μmol/L，在15 μl体系中进行扩增。lncRNA ATB引物序列，上游：5'-TCTGGCTGAGGCTGGTTGAC-3'，下游：5'-ATCTCTGGGTGCTGGTGAAGG-3'。以GAPDH为内参，上游：5'-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3'，下游：5'-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3'。PCR扩增参数：95℃ 10 min预变性；95℃ 15 s，70℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt表示lncRNA ATB的相对表达量。

1.3 随访

采用电话或门诊的方式对患者进行随访，每月随访1次，随访时间为5～36个月，起始时间为2012年1月15日，截止时间为2019年1月20日。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。服从正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，配对资料采用配对t检验。计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析lncRNA ATB评估患者预后的效能。采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，Log-rank检验比较生存情况。影响因素的分析采用Cox单因素及多因素回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中lncRNA ATB 相对表达量的比较

食管鳞状细胞癌组织中lncRNA ATB相对表达量为（9.23±2.50），明显高于癌旁组织的（6.53±2.04），差异有统计学意义（t=8.837，P＜0.01）。

2.2 食管鳞状细胞癌患者的生存情况及lncRNA ATB 相对表达量

食管鳞状细胞癌患者1年、2年、3年生存率分别为90.53%（86/95）、74.74%（71/95）、68.42%（65/95）。通过为期3年的随访，食管鳞状细胞癌死亡患者lncRNA ATB相对表达量为（9.94±2.72），明显高于生存患者的（7.69±2.03），差异有统计学意义（t=4.025，P＜0.01）。

2.3 lncRNA ATB 相对表达量评估食管鳞状细胞癌患者预后的效能

lncRNA ATB相对表达量评估食管鳞状细胞癌患者预后的曲线下面积（area under curve，AUC）、灵敏度、特异度、约登指数及最佳截断值分别为0.853（95%CI：0.765～0.917）、75.00% 、87.30% 、0.623、9.34。（图1）

图1 lncRNAATB 相对表达量评估食管鳞状细胞癌患者预后的ROC曲线

2.4 不同临床特征的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中lncRNA ATB表达情况的比较

以lncRNA ATB评估食管鳞状细胞癌患者预后的最佳截断值9.34作为临界点，将患者分为lncRNA ATB高表达组（lncRNA ATB≥9.34）及lncRNA ATB低表达组（lncRNA ATB＜9.34）。不同性别、年龄、肿瘤位置的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中lncRNA ATB表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤直径、分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中lncRNA ATB表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=18.788、8.461、6.711、15.130，P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞状细胞癌组织中lncRNA ATB的表达情况（n=95）

2.5 不同lncRNA ATB 相对表达量患者生存情况的比较

33例lncRNA ATB≥9.34的食管鳞状细胞癌患者1年、2年、3年累积生存率分别为75.76%、57.58%、51.52%，明显低于62例lncRNA ATB＜9.34患者的98.38%、83.87%、75.80%，差异均有统计学意义（χ2=12.860、7.887、5.781，P＜0.05）。（图2）

图2 lncRNAATB≥9.34（n=33）及lncRNAATB＜9.34（n=62）食管鳞状细胞癌患者的生存曲线

2.6 食管鳞状细胞癌患者生存情况的影响因素分析

将性别（男=1，女=0）、年龄（≥60岁=1，＜60岁=0）、肿瘤位置（中、下段=1，上段=0）、肿瘤直径（≥5 cm=1，＜5 cm=0）、分化程度（低分化=1，中、高分化=0）、TNM分期（Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴结转移（是=1，否=0）、新辅助放化疗（无=1，有=0）、lncRNA ATB（≥9.34=1，＜9.34=0）纳入Cox单因素分析，结果显示，TNM分期、淋巴结转移、新辅助放化疗及lncRNA ATB可能与食管鳞状细胞癌患者生存情况有关。进一步将TNM分期、淋巴结转移、新辅助放化疗及lncRNA ATB纳入Cox多因素分析，结果显示，TNM分期、淋巴结转移、新辅助放化疗及lncRNA ATB是食管鳞状细胞癌患者生存情况的影响因素。（表2）

表2 食管鳞状细胞癌患者生存情况的影响因素分析

3 讨论

lncRNAATB定位于人类第14号染色体，长度为2246个核苷酸[9-10]。lncRNA ATB含有多个miRNA-200结合位点，可通过竞争性结合miRNA-200参与肿瘤的发生发展[11-12]。已有研究证实，lncRNA ATB参与胃癌、胰腺癌及肾癌等肿瘤的发生发展，并与患者临床特征及预后关系密切[13-15]。但关于lncRNA ATB与食管鳞状细胞癌患者预后的关系未见报道，因此本研究对其进行探讨。

本研究结果发现，食管鳞状细胞癌组织中lncRNA ATB相对表达量明显高于癌旁组织，提示lncRNA ATB可能与食管鳞状细胞癌的发生存在联系。结合临床特征发现lncRNA ATB表达情况与食管鳞状细胞癌患者肿瘤直径、分化程度、TNM分期、淋巴结转移可能有关，提示lncRNA ATB可能参与食管鳞状细胞癌的发展。本研究对食管鳞状细胞癌患者进行随访，了解患者预后情况，并比较不同预后患者的lncRNA ATB相对表达量，结果显示，死亡患者lncRNA ATB相对表达量明显高于生存患者，因此推断lncRNA ATB或许可作为评估食管鳞状细胞癌患者预后的潜在生物标志物。为验证推断，本研究通过构建ROC曲线对lncRNA ATB评估食管鳞状细胞癌患者预后的价值进行分析，结果显示lncRNA ATB评估患者预后的AUC为0.853，表明lncRNA ATB评估食管鳞状细胞癌患者预后的效能较高。同时比较不同lncRNA ATB表达情况的食管鳞状细胞癌患者的累积生存率发现，lncRNA ATB≥9.34的食管鳞状细胞癌患者1年、2年、3年累积生存率明显低于lncRNA ATB＜9.34的患者。上述结果提示lncRNA ATB可能与患者生存预后存在联系，进而本研究采用Cox单因素及多因素分析对食管鳞状细胞癌患者生存预后的影响因素进行分析，结果显示TNM分期、淋巴结转移、新辅助放化疗及lncRNA ATB是食管鳞状细胞癌患者生存预后的影响因素，lncRNA ATB相对表达量越高，食管鳞状细胞癌患者的死亡风险越高。

综上所述，食管鳞状细胞癌患者lncRNA ATB相对表达量升高，与患者的预后关系密切，检测lncRNA ATB相对表达量有助于早期评估患者预后情况。此外本研究还为食管鳞状细胞癌的治疗提供了新的靶点。本研究下一步将进行动物实验，对lncRNA ATB具体作用靶点及机制进行探讨。