石斛组6种石斛主要化学成分差异分析

王晓媛，王彦兵，李泽生，李 标，丁 刚，白燕冰,*

(1.广西大学 农学院，广西 南宁 530004；2.云南省德宏热带农业科学研究所，云南 瑞丽 678600；3.中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室/中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193)

石斛(Dendrobium)作为“药食同源”植物，不仅具有珍贵的药用价值，还具有较高的食用营养成分[1]。石斛的生物活性成分主要有多糖、石斛碱、酚类、必需氨基酸、倍半萜类、甾体类、芪类和木质素类等[2-5]。多糖是石斛主要活性成分之一，大量研究表明，石斛多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力[6-7]；石斛碱具有消炎止痛、保护神经、抑制肿瘤活性的功效[8-9]；醇溶液性成分中含有丰富的芪类(二苯乙烯类)化合物[10]；氨基酸有一定的生理意义，起到防病保健的作用[11]。石斛在国内外都具有很大的药用开发价值和广阔的药品保健品市场。野生铁皮石斛市场需求量较大，但目前人工繁育种植仍存在一定的限制。研究开发其他品种的石斛是缓解铁皮石斛资源稀缺的可行性措施。研究表明，目前实际具有开发价值的石斛并不多，药用最为广泛的主要有铁皮石斛(D.officinale)、金钗石斛(D.nobile)、霍山石斛(D.huoshanense)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、齿瓣石斛(D.devonianum)等[2,12]，对于其他石斛的研究开发相对较少，不利于石斛的种质资源保护。

本研究拟对石斛属石斛组(sect.Dendrobium)6种石斛(线性石斛、蜻蜓石斛、杓唇石斛、叠鞘石斛、流苏石斛、细叶石斛)的多糖、醇溶性成分、石斛碱和17种氨基酸的含量进行测定，旨在了解不同种质石斛的化学成分含量和差异，为各种石斛资源的较好利用和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试剂

供试石斛均采自云南省德宏热带农业科学研究所石斛种质资源圃保存的原生种石斛，详情见表1。采集时间为2017年3月，采集部位为一年生茎段。石斛鲜条于55 ℃烘箱内烘干，粉碎后过三号筛备用。

表1 石斛样品来源Tab.1 Source of Dendrobium samples

葡萄糖对照品，中国食品药品检定研究院，批号110833- 200904；石斛碱对照品，北京北纳创联生物技术研究院，批号17012003；苯酚、萘(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸钠和茚三酮为进口试剂。

1.2 仪器与设备

HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；D- 37520型高速离心机，德国Heraeus公司；ME204型电子分析天平，上海恒勤仪器设备有限公司；G2X- 9240MBE型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；RETSCH MM400型组织磨样器，济南泰和盈科商贸有限公司；TGL20MW型台式冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；Biochrom30+型全自动氨基酸分析仪，大昌华嘉商业(中国)有限公司；SN251668型生物芯片分析仪，美国伯腾公司；6890N型气相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1多糖含量测定

参照文献[2]测定多糖含量。选用紫外分光光度法，在488 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程y=0.030 1x+0.004(r=0.999 9)。根据吸光度及标准曲线计算样品多糖(以葡萄糖计)含量。

1.3.2醇溶性成分测定

参照文献[2]测定醇溶性成分含量。以95%乙醇作溶剂，以干燥品计算供试品中醇溶性成分的含量。

1.3.3石斛碱含量测定

参照文献[2]测定石斛碱含量，参照气相色谱法测定结果[2,13]。

1.3.4氨基酸含量测定

准确称取石斛粉末样品0.2 g(精确到0.000 1)，于10 mL安剖瓶中，加入10 mL 6 mol/L盐酸，测定除色氨酸以外的17种氨基酸，参照GB/T 5009.124—2003执行[14]。

1.4 数据处理

每项实验平行重复测定3次，取平均值，所有数据经Origin 85和SPSS 20.0软件分析。采用Origin 85进行标准曲线绘制及含量计算；采用SPSS 20.0进行氨基酸主成分分析及各成分相关性分析。

2 结果与分析

2.1 多糖含量分析

对石斛组6种石斛多糖含量的测定结果见表2。不同石斛的多糖含量差异较大(P<0.05)。多糖含量最高的是流苏石斛，质量分数为26.90%，最低的是蜻蜓石斛，质量分数仅为6.92%，二者相差3.9倍。所有石斛样品均来自同一产地，说明该批石斛多糖含量的差异主要来自基因型的不同，结果与刘文杰等[15]研究结果一致。多糖是石斛的主要药性成分，若以多糖含量高低衡量石斛品质的优良，本研究结果表明，流苏石斛、叠鞘石斛品质较优。

表2 6种石斛的多糖、石斛碱和醇溶性成分的含量Tab.2 Content of polysaccharides,dendrobium alkaloids and alcohol soluble components in six species of Dendrobium %

2.2 醇溶性成分含量分析

对6种石斛的醇溶性成分含量进行了测定(表2)，结果发现，6种石斛的醇溶性成分含量有显著差异(P<0.05)。醇溶性成分质量分数最高的是线叶石斛，为13.01%，流苏石斛质量分数最低，为3.82%。其他石斛的醇溶性成分含量差异不大，由高到低依次为杓唇石斛、细叶石斛、蜻蜓石斛、叠鞘石斛。本研究结果中，所有石斛除流苏石斛外，醇溶性成分质量分数均高于中国药典(不得少于6.5%)的要求，可作为研究醇溶性成分药性药效实验的优良材料。

2.3 石斛碱含量分析

由表2可知，6种石斛样品仅检测到线叶石斛中存在少量石斛碱，质量分数为0.019%，低于中国药典标准0.40%，其余石斛未检测到相应峰值。大量研究表明，石斛碱是金钗石斛的特征成分，目前未见其他石斛含较高含量的石斛碱。

2.4 氨基酸含量分析

2.4.1氨基酸成分和含量测定结果

6种石斛的17种氨基酸成分和含量测定结果见表3。由表3可知，氨基酸总量为3.58%～8.09%时，其质量分数由高至低依次是蜻蜓石斛、线叶石斛、流苏石斛、杓唇石斛、叠鞘石斛、细叶石斛。所有样品中含量最高的3种氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸，蛋氨酸、胱氨酸和组氨酸含量最低。

进一步分析6种石斛样品中的必需氨基酸、非必需氨基酸、儿童必需氨基酸、支链氨基酸、药用氨基酸以及它们分别占总氨基酸含量的比率。结果表明(表3)，所有样品的必需氨基酸质量分数为1.39%～3.10%，必需氨基酸占总氨基酸比率均接近40%。6种石斛除流苏石斛外，必需氨基酸占非必需氨基酸的比率都超过了60%，其中杓唇石斛的必需氨基酸占非必需氨基酸的比率高达68.02%。根据FAO(联合国粮农组织)和WHO(世界卫生组织)提出的蛋白质理想模式，即必需氨基酸占总氨基酸含量为40%，占非必需氨基酸含量为60%以上[16]。本研究结果表明，除流苏石斛外，其他5种石斛均接近理想模式，说明5种石斛含有的蛋白质是一种优良的蛋白营养来源，有较大的开发潜力。充足的儿童氨基酸(His、Arg)[17]能有效促进孩子生长发育，有利于身体健康，6种石斛中儿童氨基酸占总氨基酸比率为9.33%～16.57%。支链氨基酸(Val、Ile、Leu)[17]具有提高运动能力、缓解运动性疲劳、减轻肌肉酸痛和增强免疫的优良功效。所有石斛样品的支链氨基酸占总氨基酸比率为11.74%～38.55%，占比超过25%的样品从高至低依次是叠鞘石斛、细叶石斛和杓唇石斛。另外，所有石斛还具有丰富的药用氨基酸(Asp、Glu、Gly、Arg、Met、Phe、Ile、Leu和Lys)[17-18]，6种石斛药用氨基酸占总氨基酸比率均在60%以上。

2.4.2氨基酸主成分分析

将6种石斛中的氨基酸进行主成分分析，17种氨基酸主成分得分系数矩阵及特征值见表4。前5个主成分累计方差贡献率达到了100%，其中第1主成分方差贡献率最大，占91.05%，说明第1个主要成分在石斛组石斛氨基酸质量评价中起主导作用，前5个主成分已包含17种氨基酸的全部信息。第1主成分特征值为15.48，累计贡献率为91.05%，Ser、Tyr、Phe等氨基酸有较高载荷，说明第1成分主要反映了Ser、Tyr、Phe等氨基酸指标的信息；同理，第2主成分特征值为0.93，累计方差贡献率为96.54%，主要反映了Thr、Lys、Arg等指标的信息；第3主成分特征值为0.37，累计方差贡献率为98.7%，主要反映了Pro、Ile等指标的信息；第4主成分特征值为0.16，累计方差贡献率为99.61%，主要反映了Glu、Cys、Met、Leu等指标的信息；第5主成分特征值为0.07，累计方差贡献率为100%，主要反映了Asp、Gly、Ala、Val、His等指标的信息。即前5个主成分已包含了17种氨基酸的全部信息。

表3 6种石斛的氨基酸含量Tab.3 Content of amino acid in six species of Dendrobium %

n=3；T：氨基酸总量；a：必需氨基酸总量；b：非必需氨基酸总量；c：儿童氨基酸总量；d：支链氨基酸总量；e：药用氨基酸。

根据各氨基酸在不同因子上的载荷，可确定Ser、Tyr、Phe 3种氨基酸为石斛组石斛的特征氨基酸。

2.5 4种化学成分含量相关性分析

4种化学成分含量相关性分析见表5。石斛中不同的化学成分在含量上存在一定的相关性：多糖含量与醇溶性成分、氨基酸总量之间呈负相关；醇溶性成分与氨基酸相互之间呈正相关。

3 讨论与结论

本研究发现，石斛属石斛组的6种石斛含有丰富的多糖、醇溶性成分和氨基酸，且差异显著(P<0.05)。供试石斛来自同一产地，化学成分含量差异主要取决于基因型影响，这与文献[11]中的研究结论一致。流苏石斛多糖质量分数为26.90%，高于中国药典规定(25%)，其在传统医学中是中药石斛的来源之一，深入研究其化学成分和药理活性具有重要意义。这一结果表明，种植地的环境条件、栽培模式比较适宜该种质流苏石斛的多糖积累。6种石斛除流苏石斛外，醇溶性成分质量分数都超过药典标准6.5%，丰富的醇溶性成分含量为进一步分析其中单一成分提供数据支持。6种石斛中仅线叶石斛检出石斛碱，且含量极低，未达到2015年版中国药典标准。6种石斛的氨基酸种类齐全，均含有被检测的17种氨基酸，除流苏石斛外，其他5种石斛均接近FAO/WHO提出的理想模式。儿童氨基酸(占氨基酸总量的9.33%～16.57%)、支链氨基酸(占氨基酸总量的11.74%～38.55%)及药用氨基酸(占氨基酸总量的62.41%～67.74%)等功能性氨基酸含量较为丰富。分析结果表明，6种石斛具有较高的药用价值和营养价值。6种石斛氨基酸主成分分析表明，前5个主成分已包含17种氨基酸的全部信息，可作为功能氨基酸的描述性指标。主成分分析确定的Ser、Tyr、Phe 3种氨基酸为石斛组石斛特征氨基酸，可为进一步建立石斛组石斛化学成分分类方法及深入研究和开发石斛组石斛提供参考依据。

表4 17种氨基酸主成分得分系数矩阵及特征值分析Tab.4 Score coefficient matrix and eigenvalue analysis of 17 amino acids

表5 6种石斛中不同化学成分的相关分析Tab.5 Correlation analysis of different chemical components in six species of Dendrobium

从植物学的角度分类，6种石斛都属于石斛属石斛组，然而该分类方式无法体现石斛中主要化学成分的差异性，不利于针对性地进行成分分析。化学成分相关性分析表明，多糖含量与醇溶性成分、氨基酸总量之间呈负相关；醇溶性成分与氨基酸之间呈正相关，该分析结果与灯笼组石斛[19]有一定差异性，说明各类群之间存在一定差异性，应分别加以研究。石斛组6种石斛化学成分差异显著，仅从外观形态对石斛进行分组存在一定局限性，其分类有待进一步研究和探讨。不同化学成分表明其药理作用不同，应分别进行研究，以便科学高效地开展石斛优良品种选育。