酿酒酵母PDEs基因缺失对蓝莓果酒抗氧化及挥发性物质的影响

马国为，姚 婷，谈太聪，何欣萌，张亮然，王友升,*

(1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；2.山东大学 微生物技术国家重点实验室，山东 济南 250100)

蓝莓果实富含矿物质、微量元素、维生素以及多酚类物质等，具有抗氧化、保护视力、增强心脏功能、软化血管、增强人体免疫力等功能[1-2]。蓝莓生产的季节性和区域性限制了蓝莓的贮藏和销售，因此蓝莓的生产和加工引起了生产者和消费者的广泛关注[3]。蓝莓果酒的加工不仅解决蓝莓储藏的问题，还可以有效保留果实原有的营养价值，提高其附加值[4]。在果酒酿造过程中，酿酒酵母菌种、糖度、酸度、温度和SO2浓度是影响果酒发酵质量的重要因素[5]。已有研究表明，酵母菌种是影响果酒风味的关键因素之一[6]。

酿酒酵母的生存活力以及发酵特性主要受高酒精度、高渗透压、氧化胁迫、低pH值等胁迫条件的影响[7]；而酿酒酵母内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)信号转导通路在调控细胞的增殖、分化、代谢以及对胁迫条件的抗性发挥着至关重要的作用[8]。环核苷酸磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterase，PDEs)通过自身的磷酸化调节细胞内第二信使cAMP或cGMP的信号传导过程[9]。PDEs超家族可分I型和II型两大类，酵母中含有yPDE1(Ⅱ型)和yPDE2(Ⅰ型)两种PDEs，yPDE1和yPDE2在酵母细胞中发挥着不同的生理功能[10-11]。在对cAMP/cGMP信号通路调控酿酒酵母生存活力的研究中发现，yPDE1在反馈抑制葡萄糖诱导的cAMP信号通路发挥着特定功能[12]，yPDE2过量表达可提高酵母对氧化胁迫和酒精胁迫的耐受性[13-14]。由此可见，PDEs基因缺失能够影响酿酒酵母的活性。已有研究表明，PDEs突变菌株能提高果酒发酵速率[15]，但对于利用PDEs基因缺失的酿酒酵母进行蓝莓果酒发酵特性的研究目前未见相关报道。

本研究拟采用蓝莓果实为原料，通过比较野生型酿酒酵母与PDEs基因缺失菌株酿造的果酒理化特性、抗氧化能力、活性物质和挥发性物质含量，探究PDE1和PDE2基因对酿酒酵母的发酵特性的影响，以期为筛选优良酿酒酵母提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1实验材料

菌株：野生型酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，为本实验室保存菌株。结合同源重组原理和醋酸锂酵母高效转化实验进行基因敲除。PDE1和PDE2基因单拷贝敲除菌株分别为PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2突变菌株，PDE1和PDE2基因双拷贝敲除菌株分别为Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2突变菌株。

蓝丰蓝莓：山东蓝莓生产基地提供，蓝莓初始可溶性固形物含量(SSC)为10.6°Brix，总酸质量浓度为6.87 g/L。

1.1.2实验试剂

引物由Invitrogen公司负责合成；DNA分子质量标准2×TaqPCR Master Mix、6×loading buffer(溴酚蓝)以及MarkerⅦ，天根生化试剂公司；Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes、polyethylene glycol和lithium acetate dihydrate，美国Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(tris methyl aminomethane，Tris)、hygromycin B、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、G418 sulfate、Triton-X100和乙二胺四乙酸钠(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，美国Amresco公司；偏重亚硫酸钾、偏重亚硫酸钠、果胶酶(30 000 Da)等均为食品级，上海和氏璧化工有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、结晶紫、葡萄糖等均为分析纯；酵母浸粉、蛋白胨、琼脂均为生物试剂。

1.2 仪器与设备

HQ45型恒温摇床，武汉中科科仪技术发展有限公司；5810R型高速离心机，美国Eppendorf公司；生物安全柜，美国Thermo公司；PCR仪，美国Bio- Rad公司；QP2010型气相色谱- 质谱联用仪，日本岛津公司；PC- 420D型固相微萃取工作台，Corning 公司；PR- 201型数字式糖度计，上海右一公司；Mole-cular Devices SpectraMax 190型酶标仪，上海艾研生物科技有限公司；T6型新世纪分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1蓝莓果酒酿造

挑选成熟度高、无腐烂变质的新鲜蓝莓，用清水洗净、打浆。向果浆中加入100 mg/L果胶酶，酶解2 h，用纱布过滤除去残渣，添加蔗糖将蓝莓汁的SSC调至22°Brix。蓝莓汁中加入200 mg/L偏重亚硫酸钾进行4 h杀菌，最后将野生型酿酒酵母(WT)及4株PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2突变菌株分别接种到等量蓝莓汁中，接种量均为2×107CFU/mL。将发酵罐放置在20 ℃条件下进行恒温发酵，每天搅拌2次。发酵结束后，将蓝莓酒进行皮渣分离，果酒滤液密封保存进入陈酿期，陈酿结束后再进行过滤灌装即得成品。

1.3.2蓝莓果酒发酵特性测定

1.3.2.1 理化指标测定

pH：采用酸度计测。总酸：采用碱式滴定法测定。酒精度：采用比色法测定[16]。糖度：采用硫酸- 苯酚比色法测定[17]。每项测定各重复3次。

1.3.2.2 抗氧化能力测定

DPPH自由基清除能力的测定参考文献[18]方法；羟自由基清除能力的测定参照文献[19]方法；ABTS自由基清除能力的测定参考文献[20]方法。各项实验均将自由基清除率为50%定义为1个活性单位(U)，样品自由基清除能力表示为单位质量(g)新鲜样品中含有的活性单位(U/g)。

1.3.2.3 活性物质含量测定

总酚的测定参照文献[21]方法，并略有改进：以没食子酸作标准曲线，总酚含量换算为每100 g新鲜样品中没食子酸当量值(mg/100 g)。总黄酮含量测定参考文献[22]方法：以芦丁标准品制作标准曲线，总黄酮含量换算为每100 g新鲜样品中芦丁当量值(mg/100 g)；花青素含量的测定参照文献[23]方法。

1.3.2.4 挥发性物质测定

采用SPME- GC/MS法测定蓝莓果酒的挥发性物质。取3 g待测样品，装入15 mL样品瓶，加0.9 g氯化钠和转子，密封后50 ℃、400 r/min条件下平衡20 min，75 μm CAR/PDMS萃取头进行萃取，50 ℃萃取30 min后，GC进样口解析3 min，同时启动仪器采集数据。

色谱柱：SPB- 50毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。升温程序：初温50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升温至150 ℃，再以5 ℃/min的速度升温至250 ℃保持5 min。载气(He)流速为1.0 mL/min，不分流进样。质谱条件：接口温度为250 ℃，离子源温度220 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描质量范围为50～600 u。利用质谱与保留指数两者结合定性，采用TIC峰面积归一化法对果酒中挥发性物质进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 野生型及突变体菌株酿造的蓝莓果酒品质指标比较

图1 不同酿酒酵母发酵的蓝莓果酒的品质变化Fig.1 Change of quality in blueberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae

接种不同酿酒酵母的蓝莓果酒发酵过程中pH值、酒精度、总糖、总酸的变化情况见图1。野生型酿酒酵母以及4株PDEs基因缺失菌株发酵的蓝莓果酒在发酵过程中总糖、酒精度、总酸、pH值的变化趋势基本一致。由图1(d)可知，Δpde1/Δpde1菌株利用糖的效率最高，而PDE1/Δpde1菌株利用糖的效率最低。Δpde1/Δpde1菌株在发酵前6 d酒精度增加速度最快，PDE1/Δpde1菌株增加速度最慢，与利用糖的效率呈正相关。Δpde2/Δpde2菌株发酵结束后总酸度最高，为7.18 g/L，是野生型的1.2倍。实验结果表明，与野生型酿酒酵母相比，PDE1/Δpde1菌株降低蓝莓果酒的发酵速度，而Δpde1/Δpde1、Δpde2/Δpde2和PDE2/Δpde2菌株均会提高蓝莓果酒发酵速度，其中Δpde1/Δpde1菌株的发酵速度最快。

2.2 野生型及突变体菌株酿造的蓝莓果酒的抗氧化能力比较

不同小写字母代表不同菌株发酵的蓝莓果酒的抗氧化能力之间差异显著。图2 不同酿酒酵母发酵的蓝莓果酒抗氧化指标的变化Fig.2 Changes of antioxidant index in blueberry wine fermented by different strains of Saccharomyces cerevisiae

比较不同酵母菌株发酵的蓝莓果酒的抗氧化能力差异，结果见图2。由图2(a)可知，野生型发酵的蓝莓果酒对DPPH自由基的清除能力为942.76 U/g，PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株发酵的果酒清除能力分别是野生型的55%、42%、51%和31%；同时，图2(b)结果显示，野生型酵母发酵的蓝莓果酒ABTS自由基清除能力为2 387.92 mg/100 g，PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2发酵的果酒ABTS自由基清除能力与野生型能力接近，而Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株的能力分别是野生型的76%和67%；此外，野生型酵母发酵的蓝莓果酒羟自由基清除能力为141.72 U/g，Δpde1/Δpde1菌株发酵的果酒羟自由基清除能力达到野生型的1.3倍，而PDE1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2发酵的果酒羟自由基清除能力仅为野生型的49%、75%和24%。结果表明，与野生型酿酒酵母相比，PDEs基因缺失菌株会降低蓝莓果酒对DPPH和ABTS自由基的清除能力，且Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株的清除能力低于PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2的清除能力；Δpde1/Δpde1菌株会提高对羟自由基的清除能力。综合比较，Δpde1/Δpde1菌株的抗氧化能力强于Δpde2/Δpde2菌株的抗氧化能力。

2.3 野生型及突变体菌株酿造的蓝莓果酒中活性物质含量的比较

不同小写字母代表不同菌株发酵的蓝莓果酒中活性物质之间差异显著。图3 接种野生型和突变菌株的蓝莓发酵醪液中活性物质含量Fig.3 Content of active substances of fermented mash with wild and mutant strains

比较接种不同酿酒酵母的蓝莓果酒中总酚、总黄酮和花青素含量的差异，结果见图3。PDEs基因缺失菌株发酵的蓝莓果酒的总酚与总黄酮含量与野生型相比差异显著。野生型酿酒酵母发酵的蓝莓果酒总酚质量比为3.24 mg/100 g，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株发酵的蓝莓果酒总酚含量分别为野生型的1.5，1.3和1.15倍，而PDE1/Δpde1菌株发酵的蓝莓果酒中总酚含量低于野生型。同时，野生型发酵的蓝莓果酒的总黄酮质量比为20.53 mg/100 g，4株突变体发酵的蓝莓果酒中总黄酮含量均低于野生型，依次是野生型的63%、65%、69%和18%。相比而言，Δpde2/Δpde2菌株发酵的蓝莓果酒中花青素含量是野生型的1.03，PDE1/Δpde1菌株发酵的蓝莓果酒中花青素含量与野生型菌株无显著性差异，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2菌株发酵的果酒中花青素含量低于野生菌株，依次是野型菌株的92%和90%。结果表明，与野生型酿酒酵母相比，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株会提高蓝莓果酒的总酚含量；PDEs基因缺失会降低蓝莓果酒中总黄酮含量，且Δpde2/Δpde2菌株酿造的蓝莓果酒中总黄酮含量最低；PDEs基因缺失对蓝莓果酒中花青素含量影响较小。

2.4 蓝莓果酒抗氧化能力与活性物质的相关性分析

对蓝莓果酒的抗氧化能力与活性物质含量进行相关性分析，结果见表1。由表1可知，蓝莓果酒的抗氧化能力与总黄酮含量呈正相关，其中ABTS自由基清除能力与总黄酮含量的正相关性达到显著水平；相比而言，羟自由基清除能力与总酚含量呈正相关，但不显著，而DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均与总酚含量呈负相关；DPPH自由基清除能力与花青素含量呈正相关，而ABTS自由基清除能力和羟自由基清除能力与花青素含量呈负相关。分析结果表明，总黄酮可能是蓝莓果酒抗氧化能力的关键活性物质，而且也可能存在其他活性物质对蓝莓果酒的抗氧化能力起重要作用。

表1 果酒抗氧化能力与活性物质的相关性分析Tab.1 Correlation analysis between antioxidant capacity and active components of blueberry wine

2.5 野生型和突变菌株酿造的蓝莓果酒挥发性物质比较

从5种不同菌株发酵的蓝莓果酒中共检测到33种挥发性物质，实验结果见表2。表2中，包括10种醇类物质、11种酯类物质、4种酸类物质、3种酚类物质、3种醛类物质、1种酮类物质和1种烃类物质。图4为不同酿酒酵母发酵的蓝莓果酒中挥发性物质含量，PDE1/Δpde1菌株发酵的果酒中醛类物质为主要成分，其次是醇类物质；而其他4种菌株发酵的蓝莓果酒中醇类物质含量最高，Δpde1/Δpde1菌株发酵的果酒中醇类物质高达83%，其次为酸类物质。

表2 野生型和突变菌株酿造的蓝莓果酒挥发性物质的种类和含量Tab.2 Species and contents of volatile substances of blueberry wine fermented by wild type and mutant strains

“—”表示未检测到该物质。

图4 5种菌株发酵的蓝莓果酒中挥发性物质含量Fig.4 Volatile components in blueberry wine fermented by five strains

醇类物质是产生果酒香气的主要成分，目前在5种蓝莓果酒中检测到的醇类物质主要有芳樟醇、苯乙醇、松油醇(表2)。研究表明，苯乙醇和香叶醇具有玫瑰花香，苯乙醇可在发酵期间产生。芳樟醇、松油醇和香茅醇能增加果酒的果香和甜香的特征[24]。PDE1/Δpde1酿造的蓝莓果酒中的醇类物质低于野生菌株，PDE2/Δpde2菌株发酵的蓝莓果酒的醇类物质高于野生菌株。Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株发酵的蓝莓果酒中的苯乙醇含量明显高于其他菌株。在突变菌株发酵的蓝莓果酒中未检测到桉树醇和香茅醇。从醇类物质的变化情况可以看出，Δpde1/Δpde1菌株发酵的蓝莓果酒醇类物质含量最高。

酯类物质是果实发酵过程中醇类物质和酸类物质发生酯化反应形成的，也是果酒香气的主体成分[25]。突变菌株酿造的果酒中酯类物质含量低于野生菌株，尤其PDE1/Δpde1酿造的蓝莓果酒只存在肉豆蔻酸异丙酯(表2)。在突变菌株中，Δpde1/Δpde1菌株发酵的蓝莓果酒醇类物质含量最高，其次为Δpde2/Δpde2。苯甲酸乙酯、苯乙醇乙酸酯、癸酸乙酯、乙酸丁香酚酯具有果香和花香的特征。Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株发酵过程中产生了乙酸丁香酚酯并增加了苯乙醇乙酸酯的合成。

检测得到的酸类物质中，辛酸占总酸类物质的60%～90%。突变菌株发酵的果酒中酸类物质总含量明显低于野生菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株发酵的蓝莓果酒中酸类物质含量最少。酚类物质主要是愈创木酚、丁香酚和异丁香酚，其中愈创木酚含量最高。愈创木酚具有独特的芬香气味，丁香酚和异丁香酚均具有浓烈的丁香香气和辛香香气。除了PDE2/Δpde2菌株，其余3株突变菌株发酵的蓝莓果酒中愈创木酚含量低于野生菌株。Δpde1/Δpde1菌株发酵过程中产生了异丁香酚。

醛类物质主要检测到壬醛、苯乙醛和5-羟甲基糠醛。苯乙醛具有水果的甜香气味，突变菌株发酵的蓝莓果酒中苯乙醛的含量低于野生菌株，在突变菌株中，Δpde2/Δpde2菌株酿造的蓝莓果酒中的苯乙醛含量最高。4种突变菌株发酵过程产生5-羟甲基糠醛，其中PDE1/Δpde1酿造的蓝莓果酒中含量最高。

3 讨 论

本研究结果表明，与野生型酿酒酵母相比，突变菌株Δpde1/Δpde1、Δpde2/Δpde2和PDE2/Δpde2均会提高蓝莓果酒发酵速度，其中Δpde1/Δpde1菌株在发酵过程中糖的消耗速度以及酒精度的上升速度最快，最能有效提高蓝莓果酒发酵速度。研究表明，PDE1对控制葡萄糖和细胞内酸化反应起着重要的生理作用，且敲除PDE1会导致酿酒酵母在添加葡萄糖后cAMP积聚更高[26]，由此可以说明，敲除PDE1基因的酿酒酵母细胞内cAMP水平会升高，信号传导速度更快，从而利用糖的速度更快。

Δpde1/Δpde1菌株发酵的蓝莓果酒的羟自由基清除能力高于野生型菌株，Δpde2/Δpde2菌株发酵的蓝莓果酒对DPPH、ABTS和羟自由基清除能力与其他菌株相比均最弱，而且Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株发酵的蓝莓果酒对DPPH和ABTS自由基清除能力分别低于PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2菌株的能力。可以推断，PDEs基因的缺失会降低酿酒酵母发酵蓝莓果酒的抗氧化能力，且PDE2基因影响大于PDE1基因，PDEs基因双敲的影响大于PDEs基因单敲。有研究指出，PDE2缺失会影响许多不同功能类别的基因，也会明显影响细胞壁的完整性[26-27]。同时，酵母细胞在以葡萄糖为碳源时，其时序寿命与Ras- cAMP信号通路的活性呈负相关[28]，因此，当PDEs基因被敲除后，细胞内信号通路活性增强，而细胞的时序寿命缩短，生成的活性物质会相应减少，从而抗氧化能力下降。又因为PDE1对cAMP亲和力和特异性低于PDE2，且有报道称酿酒酵母细胞内单独破坏PDE1基因观察不到PDE2基因被破坏时的一些表型[11]，进一步说明PDE2基因影响大于PDE1基因。

Δpde1/Δpde1菌株酿造的蓝莓果酒中总酚含量最高，PDEs基因缺失会降低蓝莓果酒中总黄酮含量，而PDEs基因缺失对蓝莓果酒中花青素含量影响较小。综合比较，Δpde1/Δpde1菌株的活性物质含量最高且抗氧化能力最强。PDEs基因缺失菌株酿造的蓝莓果酒香气成分种类和含量存在差异，突变菌株发酵的蓝莓果酒中的醇类、醛类、酮类以及烃类物质高于野生型菌株发酵的果酒，但酯类、酸类和酚类物质低于野生型菌株发酵的果酒。此外，PDEs基因双敲菌株发酵的果酒中醇类、酯类和酮类等香气成分高于PDEs基因单敲菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株发酵的果酒中香气种类较多，醇类和酯类物质含量最高。

4 结 论

通过考察野生型与PDEs基因缺失酿酒酵母对蓝莓果酒发酵特性及品质的影响，发现突变菌株中Δpde1/Δpde1菌株最能有效提高蓝莓果酒的发酵速度，PDE1和PDE2基因的缺失会降低酿酒酵母发酵蓝莓果酒的抗氧化能力，且敲除PDE2的酿酒酵母酿造的蓝莓果酒的抗氧化能力比敲除PDE1的更弱。PDEs基因双敲菌株发酵的蓝莓果酒中香气物质种类以及含量高于PDEs基因单敲菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株发酵的蓝莓果酒中芳樟醇、苯乙醇、松油醇和苯乙醇乙酸酯等香气成分含量较多。由此可知，酿酒酵母中PDEs基因敲除显著影响果酒发酵的特性，PDE2基因的敲除影响大于PDE1基因，且PDEs基因双敲的影响大于PDEs基因单敲。