区域微型生物养护剂对池塘环境改善作用研究

刘春花，梁慧丽，孙承文，陶家发，巩 华，石存斌，吴淑勤

（1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州 510380；2.广州普麟生物制品有限公司，广东 广州 510380）

【研究意义】水产养殖业常出现区域特征的大规模发病流行，与病害发生最密切相关的共性问题是养殖水体环境恶化。水质恶化时，正常的微生态平衡遭到破坏，致病菌被激活、快速繁殖，并分泌毒素侵袭鱼体，同时由于对环境变化的应激反应，鱼体抵抗力下降，导致疾病暴发或流行[1]。改善养殖水环境的传统技术手段主要是加大换水量，但这不仅浪费水资源，而且外排的养殖污水也会影响养殖区周围的生态环境。常规的药物调控方法将水体微生物、原生动物、藻类等微型生物作为药物干预的主体对象，虽然对病害防控有一定效果，但药物的过量使用常引起严重的恶性循环，水生态系统失衡，疾病也因此不断发生[2]。而通过微生物制剂优化养殖水体微生物、原生动物、藻类等微型生物多样性，则可以维护养殖环境动态相对稳定，促进养殖系统各层次关系的持续平衡，减少病害发生。

【前人研究进展】研究表明，水产养殖中应用微生物制剂不仅能分解和转化水体中的有机物和无机氮等过剩物质，提高养殖系统对营养物质的转化效率，减少水体污染，改善水质[3]，还可以通过与有害微生物竞争营养物质及生存繁殖空间等机制，抑制有害微生物的生长繁殖，降低水产动物的发病率[4]。但目前应用在水产养殖业中的微生物菌株大多是将农业部允许在畜禽饲料中添加的部分微生物、或从异地养殖区采集的微生物作为其出发菌株，将这些原来在陆地上、畜禽消化道或不同水体环境中生存的微生物直接用于水产动物，或者直接泼洒到养殖水体中，由于动物生活环境与生理状态的差异，一方面可能微生态制剂可发挥的功效有限，另一方面则有可能引起一些难以预料的生态学问题[5]。

【本研究切入点】区域池塘水体微型生物养护剂（简称护料）[2]是中国水产科学研究院珠江水产研究所研发的新型微生物制剂，具有区域属性，由养殖当地丰产池塘分离的土著微生物发酵当地农业生产次产品如麸皮、米糠、豆粕等制成，包含养殖池塘泥水、微生物菌群富集培养物和微生物培养料等组分，可根据不同养殖时期的需要，调整培养物料配比制成不同C/N比值的护料，与饲料关联使用，并适时调节水体总碱度和总硬度，以维持养殖水体生态环境动态稳定，促进健康养殖。【拟解决的关键问题】本研究通过在实验室内水族缸模拟的池塘生态环境使用护料，评价护料对水质因子、浮游藻类、原生动物及鱼体的养护作用，以探讨微型生物在水产养殖中维持水体生态环境动态稳定的作用机理与调节机制。

1 材料与方法

1.1 试验设计

2015年分别从南沙、清远草鱼养殖池塘采集塘泥及塘水，分装在实验室内设置于南向窗台的4个透光玻璃水族缸（长49 cm×宽24 cm×高34 cm）中，使缸底铺满3～4 cm塘泥，对各水族缸分别编号，各试验组的采样背景及建模时情况见表1，每个试验组设置2个重复。塘A、塘B位于广州市南沙，塘A养殖鱼体健康，生态条件良好；塘B养殖鱼体发病，采样时已使用抗生素类鱼药；塘C是清远的一口荒废老塘，水体有异味。处理1、处理3均采样自塘A，但处理1从采样过程引入水族缸的时间较处理3晚，藻体在不利环境中死亡过多，建模时藻类数量较少。试验期间对水族缸充气，以底泥不被吹起为宜。以窗台的日照为光源，且每天于8: 30—18: 00开灯补充光照，当水温降至18℃以下时，用电暖器室内加温。

表1 建模时各试验组情况Table 1 Situation of each experimental group at modeling time

1.2 实验鱼放养与存活监测

从广东肇庆某苗场购进鳙鱼（Aristichthys nobilis）（体长12±1 cm）、罗非鱼（Oreochromis mossambicus）（体长 10±1 cm）、清道夫鱼（Pterygoplichthys multiradiatus）（ 体 长 10±1 cm）等，暂养1周以上，分别向各处理引入健康的鳙鱼3尾、罗非鱼2尾、清道夫鱼2尾，用粗蛋白含量为40%的浮性饲料投喂各处理试验鱼，捞出浮于水面未摄食完毕的全部剩料，阴、雨天气时少投或停料，鱼体死亡后立即捞出，计数。

1.3 微型生物养护剂的应用

从南沙、清远草鱼养殖区的代表性高产鱼塘获得护料的制备材料，按照专利“一种区域养殖水体微型生物养护剂及其制备方法”的方法制成护料[2]。处理1、2、4使用护料制成的料水，作为试验组；处理3不使用护料，作为对照组。根据不同养殖时期的水质情况，护料在不同试验阶段的物料成分及C/N比值不同，开始模拟护料养护试验当天记作D1，D1—D24时护料的C/N比值平均为18.18，D25—D60时C/N比值平均为21.75，D60—D90时C/N比值平均为24.12。

1.4 指标监测

1.4.1 水质指标监测 将采样的泥水装入水族缸，当缸内水体澄清开始模拟护料养护试验，分别于 D1、5、10、20、30、40、50、60、90 用美国维赛仪器YIS ProPlu水质分析仪测量缸内pH值、氨氮、溶氧、水温、亚硝酸盐等各项水质指标，于D1、D90用广州普麟生物制品有限公司的总碱度、总硬度检测试剂盒分别测量缸内水体的总碱度和总硬度。

1.4.2 浮游藻类监测 于D1、5、10、20、30、40、50、60、90早上9:30采集水样，用鲁哥氏液固定、保存。计数浮游藻类的细胞数，以公式（1）计算藻类密度；计数密度较大藻类的数量，计算优势种及主要种类的百分比；参考《中国淡水藻类志》等资料鉴定藻类种类，无法定种时鉴定到属；以公式（2）计算浮游藻类的Margalef多样性指数。

式中，N为每升水中浮游藻类细胞数，A为计数结果的平均值，B为计数的血球计数板中方格数，C为浓缩的倍数。

式中，d为多样性指数，S为种类数，N为个体数。

1.4.3 底栖原生动物监测 于D10、20、30、40、50、60采集PFU泡沫（大小：50 mm×75 mm×65 mm，孔径：100～150 μm）中的水样，计数原生动物数量，以公式（3）计算原生动物密度；根据原生动物的形态，参考《水生生物学》等资料记录底栖原生动物的种类；以公式（2）计算原生动物的Margalef多样性指数。

式中，N为每升水中原生动物的数量，VD为沉淀体积，VS为采样体积，n为计算个数，C为计算体积。

2 结果与分析

2.1 水体水质理化因子

水体总碱度、总硬度有地域差异（表2），处理1、2、3（南沙）的总碱度、总硬度水平均高于处理4（清远）。试验期间，各处理pH值、溶氧、氨氮等水质理化因子如表3所示，pH值7.1～8.6，溶氧4.03～8.01 mg/L，D1—D10水温偏高、为 27～28℃，D20—D40 水温为 23～24℃，D50—D90时气温偏低，通过在室内用电暖器加热，使水温保持18～19℃；D1—D10各组的水体氨氮及亚硝酸盐浓度差异极大，处理2及处理4的氨氮与亚硝酸盐浓度极高；随后水体氨氮水平降低明显，从D20起各处理间无明显差异，维持较低水平；亚硝酸盐水平在处理1、2、3中逐步降低，但处理4在D60前无明显变化，D60后降至其他试验处理的水平。

表2 水体总碱度、总硬度检测结果Table 2 Testing result of total alkalinity and total hardness in water

表3 微型生物养护剂对水质因子、浮游藻类及原生动物的养护作用Table 3 Curing effect of micro biological conserving stuff on water quality factors, phytoplanktonand protozoa

2.2 浮游藻类的平均密度、种类与多样性

整个采样期间共有141种浮游藻类（图1），隶属6门70属，绿藻门和蓝藻门的种类数较多，分别有45属100种、11属18种，各占总种数的70.9%、12.8%。藻类的起始平均密度、种类数、多样性指数（表3、图2）均是处理4＞处理3＞处理2＞处理1，试验过程中，浮游藻类震荡增加，在护料的作用下，试验组比对照组增速快、变动幅度窄，总体增长更平稳，尤以来源于健康养殖塘的处理1特征明显；D90时平均密度、种类数及多样性指数分别依次处理4＞处理1＞处理3＞处理2、处理2＞处理4＞处理1＞处理3、处理4＞处理2＞处理1＞处理3；处理1的平均密度及种类数明显超出对照处理3，来源于不健康水体的处理2、处理4，其种类数与多样性指数明显增加，处理2的增长趋势比处理4更明显，但处理2的平均密度仍均低于对照处理3。藻类优势种及主要种类的变动情况（表4）显示，使用护料可将主要浮游藻类种类养护为绿藻门、硅藻门种类，并降低单一优势种类的比例。

图1 浮游藻类的种类组成Fig.1 Species composition of phytoplankton

表4 藻类主要种类的变动情况Table 4 Changes in major species of phytoplankton

图2 不同处理的浮游藻类平均密度（A）、种类数（B）与多样性指数（C）Fig.2 The mean density（A）, species number（B）and diversity index（C） of phytoplankton under different treatments

2.3 底栖原生动物的平均密度、种类与多样性

试验中，各处理以轮虫、纤毛虫为主，使用护料后水质得到改善，轮虫、纤毛虫数量增加。原生动物平均密度、种类数量及多样性的变动情况如表3、图3所示。试验开始时，各处理原生动物的平均密度依次为处理3＞处理1＞处理2＞处理4，种类数及多样性指数均依次为处理3＞处理1＞处理4＞处理2，试验期间呈增长趋势，D60时各处理的平均密度、种类数量及多样性指数均是处理1＞处理3＞处理2＞处理4。在护料的作用下，处理1的平均密度及多样性指数明显超出对照处理3；来源于不健康水体的处理2、处理4，其物种丰富度明显增加，处理2的增长趋势比处理4更明显，但平均密度与多样性指数仍低于对照处理3；至D60，处理1、处理2的种类数各增加3种，处理3、处理4均增加1种。

2.4 放养鱼类的存活情况

图3 不同处理的原生动物平均密度（A）、种类数（B）与多样性指数（C）Fig.3 The mean density（A）, species number（B） and diversity index（C） of protozoa under different treaments

放养鱼类的存活情况如表5所示，使用护料后，各处理存活率依次为处理1（85.7%）＞处理2（57.1%）＞平均数（50.0%）＞处理4=处理3（28.6%）。4个处理中，鳙鱼在处理1、处理2中均有1尾存活，在处理3、处理4组中全部死亡；罗非鱼在处理1中全部存活，处理2中死亡1尾，处理3、处理4中死亡2尾；清道夫鱼在处理1、处理2中全部存活，处理3、处理4中均死亡1尾。

表5 放养鱼类存活情况Table 5 The survival statistics of fish

2.5 护料对健康池塘水体的模拟养护效果

处理1、处理3均取样于南沙一口健康池塘，水质良好，水体微生物物种丰富，生态稳定。处理1在采样后处理过迟，使得试验开始时浮游藻类、原生动物损失较多，其平均密度、种类数及多样性指数均低于对照处理3。使用护料的处理1，浮游藻类D20时平均密度达到峰值，在D20—D30期间短暂降低后，藻类数量持续快速增长，整个试验期间小球藻（Chlorella vulgaris）始终维持较高比例。原生动物增长迅速，D20时即在数量上超过对照处理3；D30时种类数达到最多种，并保持不变，多样性指数达峰值，随后稍微降低。鱼体存活率高达85.7%，对水质要求较高的鳙鱼也存活良好。相比于此，不使用护料的对照处理3，采样后处理及时，浮游藻类及原生动物的起始平均密度、种类数和多样性指数均高于处理1，但试验期间浮游藻类平均密度的震荡幅度大于处理1，D30—D40期间单一种类小球藻占比极高、达70%，而D50时又骤降至20%，同时出现25%蓝藻门藻类银灰平裂藻（Merismopedia glauca）；随着气温降低、阴雨天时间延长，D60后银灰平裂藻激增、占比高达70%。原生动物增加强度不如处理1，增速慢，数量少，稳定性低，甚至在D30前的多样性指数呈下降趋势。鱼类存活率低、仅28.6%，远低于处理1，且仅剩对水质要求不高的罗非鱼及清道夫。试验结果表明，在健康塘使用护料后，浮游藻类与原生动物得到养护，放养鱼类的存活率提高。

2.6 护料对非健康池塘水体的模拟养护效果

处理2的泥、水来自南沙一口发病池塘，试验起始时构建的模拟生态条件差，氨氮水平较高，浮游藻类与原生动物的平均密度、种类数、生物多样性指数均较低；处理4采样于清远一口荒废老塘，该塘底为黏土底质，水体总碱度、总硬度水平偏低，氨氮水平极高，水体有异味，采样时蓝藻暴发。在护料的作用下，两个试验组的整体情况均得到改善，处理4在试验开始1周后水体异味消失，处理2、处理4的氨氮水平均在D20时降低，与来源于健康塘的处理1、处理3水平相当，浮游藻类与原生动物的种群平均密度提高，种类数与多样性指数明显增长，处理2的鱼类存活率为57.1%，明显高于未用护料的对照处理3。但另一方面，因处理2的来源背景较差，D60后受气温降低的影响，藻类密度缓慢降低，啮蚀隐藻（Cryptomonas erosa）与赤眼裸藻（Euglena sanguinea）增殖较快，提示水质有潜在变差的风险。而处理4起始条件差，且对水质起缓冲调节作用的碱度与硬度偏低，鱼群结构不合理，随着后期气温降低等多因素的影响下，D50时开始出现较高比例的银灰平裂藻，在D90时大量暴发，种群数量高达70%，原生动物的生物多样性水平偏低，鱼体存活率也很低、仅28.7%。由处理2及处理4的试验结果可知，只有在使用护料的同时结合调整鱼群结构、适当提高碱度、硬度等综合调控方式，才能养护池塘的生态环境稳定，促进健康养殖。

3 讨论

3.1 护料对水质理化因子的影响

养殖水体的自身污染以及对养殖地区水域生态系统的危害已经成为当前严重的环境问题，利用微生物自身生理特性进行水质净化的生物法，可以改善溶解氧，减少pH值波动，降低氨氮、硫化氢等有害物质，使水环境保持相对稳定，有效改善水质状况，使水体中有益菌种成为优势种群，从而减少病菌的滋生[6-7]。刘春花等[8]在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）养殖过程中泼洒一种商业有益微生物制剂，有利于优化养殖水体环境，与空白对照组相比，有益微生物组水体中的氨氮、亚硝酸氮盐含量显著降低。李晓英等[9]在中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）养殖池塘中施放了一种复合微生态制剂，可以使水体中的氨氮含量维持在一个相对稳定的状态，亚硝酸盐和硫化氢的含量也显著低于对照池。本研究使用的护料是一种复合微生物制剂，其功能比单一微生物制剂广泛、作用稳定、效果更佳，作用于非健康池塘水体处理2及处理4时，降氨氮的效果显著，并在模拟试验期间维持各处理的水质因子相对稳定。

3.2 护料对浮游藻类的影响

研究发现，不同的浮游藻类对氨氮和硝酸盐的利用情况有差别，Glibert等[10]报道，硅藻对硝酸氮的利用超过氨氮，在硝酸盐丰富的水体中硅藻往往是优势种，而在氨氮丰富的水体中，蓝藻和绿藻对氮的利用效率要高于其他藻类，此时蓝藻和绿藻将占据优势。而微生物则可以分解虾池中对蓝藻类等生长有积极影响的丰富有机质，并且微生物的自身分泌物对不同的藻类有不同影响[11]。庄惠如等[12]发现光合细菌（Photosynthetic Bacteria）对水中藻类有明显影响，使得有益的硅藻、绿藻数量增加，蓝藻数量降低。对南美白对虾（Penaeus vannamei）养殖池塘使用不同微生物制剂，De等[13]发现，浮游植物结构会受影响，甲藻的生物量降低；Lukwambe等[14]则发现，浮游植物的生物量减少，其中增加了硅藻门的比例，降低了蓝藻门的比例。本研究中，护料对模拟池塘水体的浮游藻类有良好的养护作用，使用护料后，藻类密度及多样性指数增速快、变动幅度窄，可将主要浮游藻类种类养护为绿藻门、硅藻门种类，可能是由于护料微生物菌株为经过持续驯化的土著微生物，可有效对模拟试验组水体中含氮营养物进行选择性利用，持续分解的代谢产物更适合当地水体绿藻门、硅藻门藻类的繁殖，促使藻类稳定增长，同时某些微生物菌株对特定藻类有抑制或溶解作用，使蓝藻不能暴发性增长，维持藻相结构的相对稳定。

3.3 护料对原生动物的影响

在池塘生态系统中，原生动物密切地与其生存的环境直接接触，能直接、迅速地反应环境变化，发生规律性变化[15-16]。池塘投入微生态制剂后，形成新的微生物群落，从而影响水生态系统中的营养盐及能量在微生物群落中的流动途径及其各种微生物之间的代谢偶联关系，接种有益微生物的水体中浮游动物数量最多，生物量最大[17]。Zink等[18]将微生物制剂应用到褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）培养中，可以增加轮虫种群的数量和种群稳定性。这些结论与本研究相同，原生动物的增长与水体饵料生物（如藻类、细菌）和营养物质（如氮）数量密切相关，使用护料的试验组，微生物菌株有效地降解水中有机物，为浮游藻类的繁殖提供营养物质，促进藻类繁殖，这些藻类的光合作用，又为好氧菌、原生动物提供氧气，从而形成一个良性的生态循环，促使原生动物的平均密度显著增加，种类数变化趋势相对稳定，多样性指数得以丰富。

3.4 护料对鱼体的影响

微生物制剂一方面通过在空间、时间、定居部位和营养等展开竞争，抑制致病菌的生存和繁殖[19]，另一方面通过刺激机体产生干扰素，有效提高免疫球蛋白浓度和巨噬细胞活性，激发机体的免疫机能，增强机体免疫力[20]，对水生动物的生存起促进作用。如芽孢杆菌（Bacillus）成为优势菌种后能产生枯草素等物质，可抑制其它细菌的生长，减少甚至消灭病原体，减少疾病发生[21]。也有研究报道，微生物制剂的有益菌可在动物肠道内繁殖，产生多种营养物质，促进机体的消化吸收功能，促进水生动物的生长[22]。本研究也进一步验证了微生物制剂对鱼体的促进作用，使用护料可显著提高放养鱼类的存活率。

3.5 护料的优势特征分析

虽然微生物制剂在动物的整个养殖过程都可以使用，但不同养殖时期的剂量及作用效果却不尽相同，在不同的水质条件下发挥出的作用与功效也不一样，有可能在使用后不适应当地气候、生态环境，导致效应期延长或使用效果不明显。在改良水质环境时，微生物制剂的菌株不可避免会与土著菌株发生竞争[23]。而当前作为水产用微生态制剂的出发菌株大多是来自畜禽消化道内的原籍菌株，这些微生物对于水产动物生理状况和生存环境究竟有何种程度的影响，尚缺乏系统研究，也没有明确结论[5]。此外，有研究证明碳氮比能改变养殖水环境中细菌群落和功能[24-25]，通过补充碳水化合物以提高水体碳氮比，可促进异养微生物利用水体中氮合成自身蛋白，从而降低水体氮化合物、提高饲料利用率[26]，一些能抑制有害病菌的益生菌比例则会随着碳氮比升高而升高[25，27]，而添加不同碳源对水体水质、藻类和微生物群落的调控存在差异[28]。本研究护料使用的菌株是经持续驯化的养殖当地丰产池塘的土著菌族，菌株培养基组方C/N动态调整，以匹配不同养殖时期的投喂饲料粗蛋白水平与池塘N积累程度。基于水产养殖发病与区域水土、气候、养殖习惯等关系密切，往往形成区域特征的发病规律，及养殖结构不尽合理，池塘C/N比值普遍较低（一般低于10）等现象，池塘微生物养护剂的应用关联了“护料-饲料-滤食性鱼类搭配”三元素，在不同养殖时期，使用承载相应期土著微生物族群和相匹配C/N的护料，优化区域养殖水体微生物、原生动物、藻类等微型生物多样性，以维护养殖环境动态稳定，进而促进养殖系统各层次关系的动态平衡，使得养殖过程不易发生疾病。

4 结论

本研究以养护养殖水体微型生物多样性为导向，以护料为载体，将土著良好菌族在同区域内共享，关键衔接养殖对象、饲料、水体总碱度与总硬度等系统元素，目标是促进“微生物-原生动物-藻类”“养殖对象-饲料-环境” “病原-宿主-环境”等多层次关系的平衡，使得病原在养殖系统多样性机制中共存而不致病。水族缸中模拟的池塘养殖环境在护料的作用下，水质因子维持在一个相对稳定的状态，藻类密度及多样性指数增速更快、变动幅度更窄，更易将主要浮游藻类种类养护为不产生藻毒素的绿藻门、硅藻门种类，原生动物种类和数量均增加明显，显著提高鱼体存活率。微生物养护技术适合于养殖区域规模化、高效、精准应用，操作简单、成本低，有利于水产养殖生态系统持续改善，可降低区域养殖病害发生率、改善养殖产品品质、提高养殖效益。