走马胎的离体培养与快速繁殖

蔡时可，梅 瑜，顾 艳，谢梅新，王继华

（广东省农作物遗传改良重点实验室/广东省农业科学院作物研究所，广东 广州 510640）

【研究意义】走马胎（Ardisia gigantifolia）又名大叶紫金牛，为紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛属（Ardisia）多年生小灌木植物，其干燥根及根茎是我国传统中药材，药用历史悠久，具有很高的药用价值，是一种药用和观赏价值极高的野生植物，主要分布于广西、广东、江西和福建等地，具有很大的开发潜力[1-2]。走马胎味辛、性温，具有祛风湿、壮筋骨和活血祛痕的功效，广泛应用于跌打损伤、风湿骨痛、产后血痕和痈疽溃疡的治疗[3]。走马胎主要药用化学成分为三萜皂苷类、岩白菜素类、香豆素类、甾醇类和挥发油类等，其中三萜皂苷类和岩白菜素类在抗肿瘤、抗氧化、抗血栓等方面具有重要意义，也是目前研究的热点[4-5]。走马胎也是民间食疗的原材料，保健产品的开发不断扩展[6]。目前，市场上的走马胎主要来源于野生采挖，随着需求量的增大，导致货源紧缺，近年来市场上有用杜鹃花科和马鞭草科植物的根或茎加工混充[7-8]。而且，过度的采挖使野生资源日益缺乏、枯竭，所以急需开展走马胎的人工种植[6]。【前人研究进展】走马胎种群的分布、对光线的响应、合适的种植条件已有研究[6,9-10]，但尚未见走马胎茎段繁育的报道，生产上以自然采摘的走马胎种子作为种源，多混杂，极易造成质量不稳定[6]。随着植物组织培养技术的普及，多种名贵中草药种苗已由植物工厂进行快速繁殖，如岗梅[11]、铁皮石斛[12-13]、牛大力[14]等。利用走马胎嫩叶为外植体，诱导出愈伤组织和不定芽分化途径的培养方法已成功[15]，但利用茎段繁殖并开展工厂化生产走马胎种苗还未见报道。【本研究切入点】走马胎的种苗是限制其发展的根本原因，本研究对走马胎的茎段组织培养参数，外植体的消毒方法、增殖和生根培养基进行探索和优化，建立走马胎的离体培养与快速繁殖技术体系，为开展工厂化生产提供参，为人工种植提供了种苗基础缓解当前种苗不足的现状。【拟解决的关键问题】组培苗的工厂化生产影响因素主要是外植体的消毒、增殖效率和移栽成活率，获得这3个环节的最佳参数是走马胎组培苗生产的关键。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年夏季在广东南雄选取生长健壮的野生走马胎植株，在广东省农作物遗传改良重点实验室培养。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基与培养条件 （1）丛芽诱导与增殖培养基：在改良MS培养基（在原MS培养基中增加54.8 mg/L FeSO4·7H2O和8 mg/L抗坏血酸）中添加适量的6-BA、KT和IBA。（2）生根培养基：在1/2改良MS培养基中添加适量IBA及NAA。所有培养基附加蔗糖30 g/L、琼脂5.5 g/L，pH值调至5.8（±0.2），经121 ℃高压灭菌20 min。培养条件：温度28（±2）℃，光照度1 900～2 100 lx，光照时间14 h/d。

1.2.2 外植体消毒 选取健康的走马胎植株幼嫩的枝条作为外植体，将枝条切成单芽茎段，先用70%酒精浸泡30 s，用无菌水冲洗3次，每次1～3 min；再用含有吐温的0.1% HgCl2溶液处理5～11 min（设 5、7、9、11 min 4个处理），用无菌水洗涤3～5次，每次5 min。用无菌的滤纸上将茎段上的水吸干，得到消毒外植体备用。切除茎段的两端接触HgCl2溶液的部位，插入诱导培养基（改良MS+ 6-BA 0.5 mg/L +KT 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L）中，每个消毒处理10个芽，培养15 d后统计污染率和萌芽率。

1.2.3 丛芽增殖 将走马胎不定芽从外植体上切下来，接种于含有不同激素浓度和种类的丛芽增殖培养基，用于继代增殖，其激素组合见表1，在继代培养基上培养20～25 d，得到走马胎的无菌丛苗。比较不同激素组合对走马胎丛芽增值的效果，统计10个芽的增殖情况。培养基以改良MS培养基为基础添加6-BA、KT和IBA。

表1 不定芽不同诱导激素组合Table 1 Different hormones combination for adventitious bud induction

1.2.4 生根诱导 从增殖的丛芽上切下带有2～3个芽的茎段，插入生根培养基中，深度约0.5 cm左右。培养基以1/2改良MS为基础，添加不同浓度的NAA和IBA，浓度组合配制见表2。生根诱导培养40～50 d，统计20株的根数量和长度。

1.2.5 种植 取根长0.5 cm以上、苗高3 cm以上的走马胎再生植株进行炼苗、移栽。在室内炼苗培养3～7 d，再用自来水冲洗干净根部的培养基，0.1%多菌灵溶液中浸泡10 min，最后将苗种在消毒过的泥炭土中，保持环境湿度。

表2 根诱导激素配方Table 2 Different hormones combinnation for rooting induction

2 结果与分析

2.1 不同方法对外植体消毒效果

经过消毒处理后的走马胎茎段外植体在诱导培养基上培养7～10 d后，大部分腋芽逐渐开始恢复、出现萌动，少部分出现褐化，长出细菌和真菌，对污染率、萌芽率和死亡率进行统计，结果（表3）表明，走马胎外植体进行消毒处理5～10 min，均能获得无菌的外植体，但成功率有差异。真菌是主要的污染源，其分布在腋芽内而消毒液无法渗入，导致消毒不彻底[1]。随着消毒时间的延长，HgCl2溶液接触外植体的面积越大，消毒也越彻底，污染率略有下降，但其对外植体的伤害却迅速增加，主要表现在外植体中出现真菌的数量越来越少，但萌芽率逐渐降低，萌芽时间滞后，而且褐化、死亡率则不断上升。走马胎外植体污染率在20%～60%之间，其中消毒9和11 min 的污染率较低，为20%；消毒11 min对走马胎的毒害最为严重，萌芽率为30%，比处理10 min低100%；消毒时间7～9 min，获得无菌外植体的成功率可达到40%～60%，满足在生产上的需求。在本研究中处理1～4均能得无菌外植体，结合萌芽率和污染率等综合分析，70%酒精预处理30 s 结合0.1% HgCl2处理7～9 min的消毒方法比较合适走马胎外植体的消毒。

表3 不同方法对外植体消毒的效果Table 3 Effect of explants disinfection by different methods

2.2 走马胎丛芽诱导与增殖效果

通过对丛生芽继代、增殖培养，能在短期内迅速提高种苗的数量，增值效率的高低决定种苗生产的成本，是进行组培苗工厂化育苗的关键。从表4、图1可以看出，6-BA、KT和IBA的激素组合都能诱导走马胎不定芽增殖，增殖效率与培养基中6-BA浓度正相关，随着浓度的升高，走马胎的增殖效率增加，在6-BA浓度2 mg/L时增殖系数达到12左右。但是此时组培苗的不定芽数目较多，导致过于密集和细弱，质量不高，不适合进行下一代的增殖。加入KT和IBA可以改善苗的均匀性，以1 mg/L NAA、1 mg/L KT和0.05 mg/L IBA的组合较适合走马胎的增殖。

表4 不同激素组合和浓度对不定芽增殖的影响Table 4 Effect of different hormones combination and concentration on adventitious bud proliferation

图1 走马胎离体增殖结果Fig.1 Buds proliferation in vitro of Ardisia gigantifolia

2.3 生根培养效果

将含有2～3个芽的茎段接入生根培养基中，进行组培苗的生根诱导。在培养40 d后，统计生根率和根的长度。结果（表5图2）表明，采用IBA和NAA的激素组合均能诱导走马胎的生根，但是和其他草本植物相比，走马胎的生根较慢，且多为主根，侧根较少。在低浓度的激素水平下，随着激素浓度的增加根的数量也相应增加，根长增长。添加0.2 mg/L NAA和0.3 mg/L IBA的处理能促进根的数量、提高根的质量，但是随着NAA和IBA浓度的增加，走马胎诱导生根的时间也增加。表明NAA浓度增加，根数量也增加，但直径略变小，其中0.5 mg/L NAA处理比0.1 mg/L NAA处理诱导的根数量增加1.25倍，长度增加46.15%，而根直径没有明显的差异。结合出根时间和根的质量，以0.2 mg/L NAA和0.3 mg/L IBA诱导的组培苗根系较好，适合后期的移栽。

表5 不同激素对走马胎根诱导的效果Table 5 Effect of different hormones on rooting induction of Ardisia gigantifolia

图2 走马胎离体诱导生根情况Fig.2 Rooting in vitro of Ardisia gigantifolia

2.4 炼苗及移栽

生根诱导培养40～60 d，走马胎幼苗的根长0.7 cm、株高3 cm左右。通过练苗，组培苗叶片变厚，质地变硬。在移栽5 d后植株挺拔，成活率在85%以上。

3 讨论

随着人口的增长和社会对中医药事业的重视，中药材的需求日益增加，但是大量的中药材还没有开展人工栽培，大多以自然采挖为主，导致野生资源被掠夺性开发，资源濒临枯竭，同时也很难满足现代中医药产业的需求[2]。近年来，中药农业逐渐兴起，特别是在中草药的人工驯化、选育和标准化种植，不断提升了中草药的质量，缓解中药原料短缺，将产生良好的生态和经济效益[3-4]。走马胎作为一种药用历史悠久中药材，同时兼具观赏价值，但由于其生长缓慢，繁殖系数较低，建立走马胎种苗的人工快速繁殖技术可缩短育苗周期，保障种苗的质量，促进走马胎规模化、标准化种植，彻底市场紧缺的困境[5]，同时，也有效保护野生走马胎的种子资源，有助于走马胎资源的稳定。

持续提供大量的种苗是进行规模化种植的基础，在走马胎生产上具有重要的意义[6]。目前植物组织培养快速繁殖在技术上非常成熟，在种苗生产中，种性稳定，保持母本优良性状是进行工厂化生产的前提，器官发生途径的变异要较愈伤组织途径低，因而在生产上大多采用茎段繁殖[7]。在生产中，无菌外植体的获得和高增殖效率是制约组培快繁的两个主要因素[8]。HgCl2在外植体消毒中应用最为广泛，但是受到环境保护的限制，酒精、84消毒液和次氯酸钠等消毒剂的应用频率开始增加[9-11]。在中草药植物的组培中，材料纤维化程度、表面是否有绒毛、蜡质，特别是生理状态等因素都会影响外植体消毒的效果[12-14]。走马胎和其他木本植物植物一样，嫩茎在0.1%HgCl2处理7～9 min进行消毒较适合。6-BA和KT是在增殖过程中常用的细胞分裂素，在生根诱导方面则主要为生长素。不同的植物对激素的敏感性存在较大差异，一般通过梯度设计得到适合的配方[15,16]。本试验结合以往的研究，通过设置6-BA和KT的浓度，得到走马胎的增殖体系。生长素中的NAA和IBA较为稳定，常用与生根诱导，两者的配合使用可以大大改善根的形态，诱导得到健壮的走马胎的根[17]。组织培养快繁技术能提供大量优质的走马胎种苗，满足市场需求，保护野生资源不受破坏，促进其在中医药产业中更好的应用。

4 结论

本研究建立的走马胎组培苗生产技术体系，包括嫩茎经过70%酒精处理30 s结合0.1% HgCl2处理7～9 min的消毒方法，优化了改良MS培养基+ 6-BA 1.0 mg/L+KT1 mg/L +IBA 0.05 mg/L的不定芽的增殖培养基和1/2改良MS培养基+ NAA 0.2 mg/L +IBA 0.3 mg/L的生根培养基配方。通过建立走马胎的离体培养与快速繁殖方法，能够开展工厂组培苗的生产，为人工种植提供充足的种苗，满足生产需求。