肝细胞生长因子和机械生长因子对肛提肌成肌细胞增殖最佳作用浓度的研究

董润楠，宋志英

研究表明，压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)患者多存在肛提肌细胞的损伤[1-2]。而肛提肌卫星细胞作为出生后肛提肌新肌纤维的唯一来源，在肛提肌损伤恢复方面具有非常重要的意义[3]。骨骼肌受损后局部微环境的改变，包括炎性细胞的浸润、炎症因子和细胞因子的释放等，可激活肌卫星细胞，使其退出静止期，进入S期开始分裂、增殖，并促进肌卫星细胞分化为成肌细胞，与受损肌细胞融合修复损伤肌细胞，或者多个成肌细胞融合形成肌管，进而生成新的肌细胞，发挥骨骼肌损伤后再生和修复作用[4-6]。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、机械生长因子(mechano growth factor，MGF)均可促进成肌细胞增殖[7-10]，本研究用不同浓度的HGF、MGF干预体外培养的人肛提肌成肌细胞，旨在筛选出HGF、MGF的最佳作用浓度，并在最佳作用浓度下，检测肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mDNA的表达，探索HGF、MGF对SUI治疗作用的可能机制，为今后局部注射生长因子治疗SUI提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 MGF、HGF购自上海Novoprotein公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自上海吉尔生化有限公司；胎牛血清(fetal calf serum，FBS)购自以色列BI公司；DMEM细胞培养基购自美国GIBCO公司；异硫氰酸荧光素(flourescein isothiocyanate，FITC)标记的羊抗兔IgG抗体购自江苏康为世纪生物科技有限公司；兔抗横纹肌辅肌动蛋白抗体(Rabbit Anti-Sarcomeric Alpha Actinin)购自北京博奥森生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒、超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒购自江苏康为世纪生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肛提肌成肌细胞复苏及鉴定 前期课题组原代分离正常产妇、妊娠期SUI患者肛提肌成肌细胞，传代培养至第3代，经α-横纹肌肌动蛋白鉴定，选择对数期生长的成肌细胞冻存。

从液氮罐中取出冻存管，一次性手套包裹，用镊子迅速将其置于37～40 ℃的温水中并不断搅动，使冻存管中的冻存物在1 min之内解冻。于超净台中打开冻存管，迅速将成肌细胞悬液吸到装有10 mL培养基(配制：DMEM+20%FBS+双抗)的离心管中，混匀，用移液枪将细胞转移至培养皿中，5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养。显微镜下观察细胞的生长状况，待细胞生长状态基本恢复正常后进行实验。

磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)浸洗已爬好细胞的培养皿3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培养皿3次，每次3 min。0.5% Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min，PBS浸洗培养皿3次，每次5 min。移液枪吸干PBS，在培养皿内滴加牛血清白蛋白溶液(5% BSA)，37℃封闭30 min，移液枪吸掉封闭液，不洗。培养皿内滴加足够量的稀释好的一抗Rabbit Anti-Sarcomeric Alpha Actinin(1:250)，4 ℃孵育过夜，PBS浸洗培养皿3次，每次3 min。移液枪吸干培养皿内多余液体后滴加稀释好的荧光二抗FITC(1∶200)，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗培养皿3次，每次3 min。滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS洗去多余的DAPI。20%甘油封闭培养皿，在荧光显微镜下观察采集图像(绿色荧光为检测的目的蛋白，蓝色荧光为细胞核)。

1.2.2 MTT法检测肛提肌成肌细胞增殖活力

1.2.2.1 实验分组 将SUI组肛提肌成肌细胞分为两组：HGF组、MGF组，两组再分别设8个浓度组：50、100、150、200、400、600、800、1 000 ng/mL，以SUI组(0 ng/mL)为空白对照，每组设6个复孔。

1.2.2.2 细胞铺板 显微镜下观察到细胞状态良好且细胞的融合度达到90%以上时，弃原培养液，PBS冲洗2次，加入1 mL胰蛋白酶(0.25%)消化3 min，再加入完全培养基终止消化。将细胞吹打下来并吸取到10 mL离心管中，1 500 r/min离心3 min，弃上清，加入培养基(配制：DMEM+10%FBS+双抗)，使用血球计数板计数方法将细胞密度重悬为1×104/mL，将重悬后的细胞加至96孔板中(每孔100 μL)继续培养。

1.2.2.3 细胞加药 显微镜下观察细胞生长至铺满70%～80%时换无血清培养液，孵育24 h使细胞同步化于G0期，将配制好的HGF、MGF各个浓度梯度的药物溶液对应加入96孔板中，每孔1 μL，空白对照组加入1 μL生长培养基，继续培养72 h。

1.2.2.4 MTT比色法检测 在细胞加药72 h后，每孔加入50 μL的MTT试剂，继续培养4 h，4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，振荡器振荡10 min，使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪在550 nm波长处测定各孔吸光度值。计算公式：细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100。

1.2.3 反转录PCR检测Laminin、Dystrophin mRNA的表达 ①将肛提肌成肌细胞分为4组：正常对照组、SUI组(0 ng/mL)、HGF组、MGF组(HGF组、MGF组均在最佳作用浓度下)，用反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)法检测肛提肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA的转录水平。②建立20 μL逆转录体系[dNTP Mix(4 μL )+Primer Mix(2 μL)+RNA Template(7 μL)+5x RT Buffer(4 μL)+DTT(2 μL)+HiFiScript(1 μL)]，将RNA通过逆转录HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒合成cDNA。③设计、合成引物，见表1。④建立25 μL逆转录体系[RNase Free dH20(9.5 μL)+cDNA/DNA(1 μL)+上游引物(1 μL)+下游引物(1 μL)+2xULtraSYBR Mixture(12.5 μL)]。⑤满足PCR反应条件：预变性(95 ℃/10 min)、变性(95 ℃/1 s)、退火(57 ℃/30 s)、延伸(72 ℃/30 s)，循环40次。⑥以GAPDH为内参，用2-△△Ct比较法算出各组肛提肌成肌细胞中Laminin、Dystrophin mRNA的相对表达量(在P<0.05的情况下，如果2-△△Ct<1，说明目的基因在试验组中表达下调；2-△△Ct>1说明表达上调；否则表达无差异)。

表1 引物信息表

2 结果

2.1 肛提肌成肌细胞鉴定 正常对照组和SUI组肛提肌成肌细胞均表达骨骼肌细胞标志性蛋白α-横纹肌肌动蛋白，图1、图2。

图1 肛提肌成肌细胞鉴定 (正常对照组)

图2 肛提肌成肌细胞鉴定(SUI组)

2.2 不同浓度HGF、MGF对肛提肌成肌细胞存活率的影响 与SUI组(0 ng/mL)相比，HGF组、MGF组肛提肌成肌细胞存活率均增加，差异比较具有统计学意义(P<0.05)，提示不同浓度的HGF、MGF对SUI患者肛提肌成肌细胞增殖均有促进作用；与其他浓度相比，当浓度为150 ng/mL时，HGF组、MGF组肛提肌成肌细胞存活率最高，差异比较具有统计学意义(P<0.05)，表2。

表2 不同浓度HGF、MGF对肛提肌成肌细胞存活率的影响(%)

2.3 各组肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA的表达情况 与正常对照组相比，SUI组(0 ng/mL)肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA相对表达量降低，差异比较具有统计学意义(P<0.05)；与SUI组(0 ng/mL)相比，HGF组(150 ng/mL)、MGF组(150 ng/mL)肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA相对表达量增加，差异比较具有统计学意义(P<0.05)，表3。

表3 各组肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA的转录(2-ΔΔCT值)

3 讨论

SUI是女性的常见病和多发病，发病率高达18.9%[11]。该病病因复杂，发病机制有多种学说，其中盆底组织受损的“吊床”学说被广泛认可[12]。肛提肌作为盆底组织中主要支撑肌肉，当该组织结构和功能发生变化，就会影响盆底功能导致尿失禁的发生[2]。而肛提肌作为骨骼肌是有丝分裂后的组织，一旦形成，细胞分裂就不会发生在肌纤维内。在产后诱导的肌肉生长过程中，所需的增殖细胞(成肌细胞)来源于肛提肌干(卫星)细胞池，它们是肛提肌生长、修复和肥大所需的额外细胞核的来源，与肌纤维分层并置，代表肛提肌自我修复的生物学储备[3]。

HGF由体内各个组织以自分泌、旁分泌或内分泌的形式产生，可与肌卫星细胞膜表面受体C-Met结合，启动相关信号转导途径,发挥骨骼肌再生修复作用[8-9]。MGF是胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)可变剪接的产物之一，由啮齿类动物和人类体内除了肝脏以外的其他组织以自分泌或旁分泌的形式产生，对机械信号极为敏感，通过其E结构域羧基端特有的氨基酸序列，独立于IGF-1及其受体，在骨骼肌损伤后修复过程中发挥作用[13-14]。研究表明，在产后、损伤后或运动骨骼肌局部，存在大量HGF、MGF，两者均可激活肌卫星细胞，促进有丝分裂从而促进成肌细胞增殖，并促进骨髓间充质干细胞的迁移，协同发挥促进肌肉肥大、肌肉组织质量增加作用[5,7-10,15-16]。

本研究用不同浓度的HGF、MGF干预体外培养的SUI患者的肛提肌成肌细胞，于干预后72 h用MTT比色法检测细胞存活率，结果显示，与SUI组(0 ng/mL)相比，HGF组、MGF组肛提肌成肌细胞存活率均增加，差异比较具有统计学意义(P<0.05)，这表明不同浓度的HGF、MGF对SUI患者肛提肌成肌细胞增殖均有促进作用，与上述结论一致。孙婧瑜和陆耀飞[10]以SD大鼠的腓肠肌卫星细胞为研究对象，通过体外试验证实了MGF的促增殖作用。吴国梁和李娜[7]则对SD大鼠的腓肠肌进行拉伸训练，发现拉伸训练后SD大鼠的腓肠肌HGF、MGF及其mRNA表达均显著上升，同时腓肠肌湿重明显增加，均证实了HGF、MGF在运动诱导的肌肉生长过程中的积极作用。

另外，本研究还发现，在0～150 ng/mL浓度范围内，相同作用时间下，肛提肌成肌细胞存活率随着HGF、MGF浓度的增加而增加，这表明在0～150 ng/mL浓度范围内，HGF、MGF以剂量依赖性的方式促进肛提肌成肌细胞增殖；在>150 ng/mL浓度范围内，促成肌细胞增殖作用逐渐减弱；与其他浓度相比，当浓度为150 ng/mL时，HGF组、MGF组肛提肌成肌细胞存活率最高，HGF组达峰值(119.620±4.043)%，MGF组达峰值(118.339±3.525)%，这表明HGF、MGF促进肛提肌成肌细胞增殖的最佳作用浓度为150 ng/mL。孙婧瑜和陆耀飞[10]筛选出的MGF促进SD大鼠的腓肠肌卫星细胞增殖的最佳作用浓度为25 ng/mL，并且发现当MGF浓度为25 ng/mL、50 ng/mL 时，MGF促进腓肠肌卫星细胞增殖的效应差异比较无统计学意义，而当MGF浓度继续增加至200 ng/mL时，几乎没有促增殖作用，这与本研究中HGF、MGF对肛提肌成肌细胞的作用趋势一致。

Laminin是由α，β和γ亚基的特定组合组成的异源三聚体蛋白，其α2链在骨骼肌的细胞外基质中高表达，Dystrophin-糖蛋白复合物由几种跨膜和外周成分组成，在骨骼肌的肌纤维膜中高表达，Dystroglycan是这种复合物的核心蛋白，外周膜蛋白α-Dystroglycan以高亲和力结合层粘连蛋白α2链，同时与跨膜蛋白β-dystroglycan相连，后者又与结合了细胞骨架肌动蛋白的Dystrophin相连，形成细胞外基质与细胞内骨架蛋白之间的机械连接[17-19]。当骨骼肌受到机械应力刺激时，细胞外基质-细胞骨架连锁遭到破坏，进而使肌纤维膜丧失稳定性、Laminin依赖性信号传导破坏、对肌肉收缩期间costameres侧向传递力耐受程度降低，最终导致多种疾病的发生。

本研究显示，SUI患者存在肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA相对表达量的降低，这说明Laminin、Dystrophin表达降低与SUI发生相关；并且发现加入150 ng/mL HGF、MGF干预后，SUI患者肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin的表达增加，这说明HGF、MGF可通过促进Laminin、Dystrophin的表达，从而在一定程度上修复SUI患者损伤的肛提肌。Dystrophin表达降低与SUI发生的相关关系在王莉娜等[20]的研究中亦得到证实。Cação-Benedini等[18]在右后肢固定(保持足背完全跖屈)10 d大鼠的比目鱼肌中发现了Laminin和Dystrophin表达的增加，以此阐明固定对骨骼肌损伤治疗作用的可能机制。至于HGF、MGF是如何促进Laminin、Dystrophin表达、发挥修复治疗作用的，其具体机制仍有待进一步研究。

综上所述，外源性HGF、MGF可通过促进肛提肌成肌细胞的增殖以及Laminin、Dystrophin的表达来修复SUI患者损伤的肛提肌，且最佳作用浓度为150 ng/mL。妊娠期和产后SUI通常是短期的，尿失禁症状多能自行恢复，但是妊娠和分娩对盆底神经和肌肉组织的长期隐性损害仍然存在，导致较早年龄分娩的妇女于围绝经期再次出现SUI[15]。所以对于妊娠期和产后SUI不能自发消退的年轻女性来说，早期局部注射生长因子疗法可能是一个好的选择，能够更安全、有效、迅速地刺激身体的细胞以促进组织愈合，既可以治疗产后SUI，也可以防止SUI发展，这种疗法很有前景，但需要在动物模型和人类中进行详细和长期的研究，同时实施注射的最佳时间点也需要进一步的实验室和临床研究。