乳制品中拟除虫菊酯类农药残留检测研究进展

梁建英，胡 雪*，谢瑞龙，刘丽君，李翠枝，张志伟

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

拟除虫菊酯是文菊花中天然成分除虫菊酯的合成类似物，是一类模拟天然除虫菊酯化学结构合成的农药[1]，其具有选择性毒性、在哺乳动物体内代谢和排泄迅速、环境残留少等特点，不仅在农业上得到广泛应用，而且在家庭用杀虫剂，如防治蚊虫、蟑螂及牲畜寄生虫的杀虫剂中被广泛应用[2]。随着拟除虫菊酯类农药越来越多地进入生活环境，其引起的环境污染与人类安全问题也越来越受到重视。

长期以来一直认为拟除虫菊酯类农药为低毒杀虫剂，然而Sinha等[3]研究表明，拟除虫菊酯可影响实验动物的神经行为，是一种重要的神经毒剂，能够改变Na+通道功能而产生神经毒性[4]，如果不加控制仍然会对人类健康造成很大威胁。农药的危害途径是其被使用后一定时期内没有被分解或降解的农药原体、降解物及有毒代谢物残留在生物体内，人类尤其是婴幼儿食用了被污染的乳制品后，残留的农药会在体内不断积累，最终导致急性或慢性中毒，因此加强乳制品中拟除虫菊酯类农药检测是保障食品安全的必要风险防控措施之一。

1 国内外对乳类中拟除虫菊酯类农药残留最大限量的要求

《食品法典》是全球消费者、食品生产和加工者、各国食品管理机构及国际食品贸易的重要基本参照标准，其中CAC/MRL 1—2001《食品中的农药最大残留限量》中规定了生乳中96 种农药的最大残留限量，其中包括10 种拟除虫菊酯类农药的最大残留限量，即氯氰菊酯0.05 mg/kg、氰戊菊酯0.1 mg/kg、氯菊酯0.1 mg/kg、溴氰菊酯0.05 mg/kg、烯虫酯0.1 mg/kg、醚菌酯0.01 mg/kg、氟氯氰菊酯0.01 mg/kg、联苯菊酯0.05 mg/kg、甲氰菊酯0.1 mg/kg[5]。

国内，根据国家卫生健康委员会、农业农村部和国家市场监督管理总局2019年第5号公告，GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[6]将于2020年2月15日正式实施，该标准规定了生乳中102 种农药的最大残留限量，其中包括7 种（同分异构体为1 种）拟除虫菊酯农药的最大残留限量，即氯氰菊酯和高效氯氰菊酯0.05 mg/kg、氰戊菊酯和S-氰戊菊酯0.1 mg/kg、醚菌酯0.01 mg/kg、氟氯氰菊酯和高效氟氯氰菊酯0.01 mg/kg、联苯菊酯0.2 mg/kg、氯氟氰菊酯和高效氯氟氰菊酯0.2 mg/kg、醚菊酯0.02 mg/kg。

通过国内外拟除虫菊酯类农药限量分析可知，国内限量标准中有4 种拟除虫菊酯类农药（氯氰菊酯、氰戊菊酯、醚菌酯、氟氯氰菊酯）与国际标准中的限量一致，联苯菊酯的限量不一致，国际标准中没有对乳类中氯氟氰菊酯和醚菊酯的限量作规定，而国内标准作了规定。

2 拟除虫菊酯类农药残留的检测方法及标准

农药残留检测是一项针对复杂混合物中微量或痕量组分进行分析的技术，不仅要有精细的微量操作手段，而且要有具有较高灵敏度的痕量检测技术[7]。农药残留检测方法已成为影响国际贸易的重要技术要求之一，因此能够简单、快速、准确定性及定量检测农药残留意义重大。

目前，拟除虫菊酯类农药残留检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法和酶联免疫分析法，由于大部分拟除虫菊酯化合物是立体异构体或几何异构体，不同异构体生物活性不同，在分析方法中如何分离异构体再进行定量测定是关键，且多数样品成分复杂、前处理干扰性大，因此，近年来高端分析仪器法，如气相色谱-三重四极杆串联质谱法、液相色谱-三重四极杆串联质谱法得到大量应用[8-10]，使得水果、蔬菜、谷物、茶叶、中草药及乳制品等不同种类样品中农药残留的准确痕量分析成为可能。沈崇钰等[11]通过固相萃取-气相色谱-负化学离子源质谱技术建立11 种拟除虫菊酯类农药残留的检测方法，并应用于茶叶；孙长恩等[12]采用HP-5MS毛细管柱和氢火焰离子化检测器建立同时测定化学杀虫剂中9 种拟除虫菊酯类农药的气相色谱检测方法；李燕等[13]对水产品可食部分中拟除虫菊酯残留量的高效气相色谱检测方法进行研究，建立同时测定氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯残留量的检测方法；胡奇杰等[14]采用带有电子捕获检测器的气相色谱对铁皮石斛饮片中拟除虫菊酯残留的检测方法进行研究，建立了一套成熟的农药多残留气相色谱检测方法；宋瑶等[15]用液-液萃取法提取、带有电子捕获检测器的气相色谱建立酸乳中4 种拟除虫菊酯类农药残留的检测方法。

我国国家卫生部门依据食品安全风险评估结果及食品生产经营者和消费者的意见，制定并颁布实施了一些有关拟除虫菊酯类农药残留的检测标准，可分为植物源性食品和动物源性食品两大类，其中，测定植物源性食品中拟除虫菊酯类农药含量的有GB/T 5009.146—2008《植物性食品中有机氯和拟除虫菊酯类农药多种残留量的测定》和GB 23200.113—2018《植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定》，测定动物源性食品中拟除虫菊酯类农药含量的有GB/T 5009.162—2008《动物性食品中有机氯和拟除虫菊酯类农药多组分残留量的测定》和GB 23200.85—2016《乳及乳制品中多种拟除虫菊酯农药残留量的测定》。

3 乳制品中拟除虫菊酯类农药残留检测的影响因素

测量不确定度的评定是评判检测实验室和校准实验室能力水平的重要指标，也是评判测试结果质量水平高低的依据[16]，其可以保证测试数据的准确度和可靠性。而在不确定度评定[17-18]过程中，会对检测方法的每个环节中容易引入误差的分量进行分析和计算，通过每个分量不确定度评定值的大小可直观地分析出所用检测方法的主要影响因素。

前期，本实验室参考GB 23200.85—2016，采用气相色谱-串联三重四极杆质谱法对牛乳、婴儿配方乳粉、酸乳、冰淇淋及干酪中氯氰菊酯、氰戊菊酯、醚菌酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯及甲氰菊酯的含量进行验证实验，结合牛乳中联苯菊酯含量的测定结果及不确定度分析，分析讨论检测方法的主要影响因素。

3.1 数学模型和不确定度传播率

首先，利用气相色谱-质谱法测定联苯菊酯的残留量（X），其数学模型中输入量分别为试样待测液中联苯菊酯的上机质量浓度（ρ）、定容体积（V）、稀释倍数（n）和样品质量（m）。

组合类似影响因素，将输入量中的重复性因素ρ、V和m组合在一起，归为输出量X的重复性因素，因此不需分别评定输入量ρ、V和m重复性引入的不确定度分量，而是直接评定输出量X重复性引入的不确定度分量。组合后的数学模型为式中，ƒrep为测量重复性影响因素修正因子，其数值为1，考察该数学模型可知，输入量ρ、V、m和ƒrep互不相关，而且联苯菊酯残留量的计算式中只有输入量ρ、V、m的积和商，因而不确定度传播率，即输出量X的合成标准不确定度ucrel（X）可由ρ的标准不确定度分量urel（ρ）、V的标准不确定度分量urel（V）、m的标准不确定度分量urel（m）和实验重复性标准不确定度分量urel（ƒrep）的平方和开根号求得，即：

3.2 不确定度来源分析与评定

输出量X的不确定度来源有4 个方面，即urel（ρ）、urel（V）、urel（m）和urel（ƒrep）。

3.2.1urel（ρ）

urel（ρ）包括4 个来源：1）标准曲线拟合引入的标准不确定度urel1（ρ），通过不确定度A类评定计算，数值较大；2）标准品纯度引入的标准不确定度urel2（ρ），通过不确定度B类评定[19]计算，均匀分布，置信因子为数值较小；3）标准溶液配制过程移液器引入的标准不确定度urel3（ρ），通过不确定度B类评定计算，三角分布，置信因子为数值较小；4）容量瓶校准引入的标准不确定度urel4（ρ），通过不确定度B类评定计算，三角分布，置信因子为数值较小。

由上述标准不确定度评定结果合成urel（ρ），分析可得其大小主要由标准曲线拟合引入的标准不确定度urel1（ρ）决定。

3.2.2urel（V）

urel（V）的主要来源为移液枪校准引入的标准不确定度u（V），通过不确定度B类评定计算，三角分布，置信因子为数值较小。

3.2.3urel（m）

m采用减量法通过2 次称量得到，包括1 次回零（空瓶）称量。每次测量不确定度都有3 个来源：天平校准、重复性、天平分辨力，重复性归入到ƒrep中，只评定分析天平校准引入的标准不确定度u1（m）和分析天平分辨力引入的标准不确定度u2（m）。因为使用同一架天平在一个很窄的质量范围内称量，因此天平质量差值灵敏度可忽略不计。通过不确定度B类评定，均匀分布，置信因子为得出结果，数值较小。

3.2.4urel（ƒrep）

峰面积测定引入的输出量X的不确定度合并到urel（ƒrep）去考虑，通过不确定度A类评定，正态分布，置信因子为1，可得出结果，数值较大。

通过对urel（ρ）、urel（V）、urel（m）和urel（ƒrep）结果的比较分析[20-21]可得，乳制品中拟除虫菊酯类农药含量测定结果的主要影响因素包括标准工作曲线拟合和测量重复性影响因素两方面。

3.3 样品前处理方法

由于实验中基质增强效应明显，乳制品中拟除虫菊酯类农药残留测定均采用空白基质配制标准溶液，绘制标准曲线，因此，样品前处理过程[22-23]的稳定性直接影响标准曲线的相关性。同时，样品前处理方法的适用性也是影响实验重复性的主要因素。因此，从根本上说影响乳制品中农药残留检测的因素是样品前处理方法。

在农药残留检测过程中，样品前处理是分析检测的关键步骤，它直接关系着整个分析过程的准确性和精密度[22-23]。乳制品中拟除虫菊酯类农药残留的检测主要采用气相色谱-串联质谱仪[24-26]进行，其常用的简单、快速、有效的前处理方法主要有固相萃取（solid phase extraction，SPE）、QuEChERS（quick, easy, cheap,effective, rugged, safe）和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）[27]。

3.3.1 SPE

SPE是一种基于色谱分离的样品前处理方法，包括固相（具有一定官能团的固体吸附剂）和液相（样品和溶剂），它的原理是通过固定相吸附剂上的官能团与目标化合物官能团之间的作用力将目标化合物保留在固相吸附剂上，使目标化合物从基质中分离出来[28-30]。根据柱填料不同，SPE柱可以分为正相萃取柱、反相萃取柱、吸附树脂柱和离子交换柱4 种类型。正相萃取柱的填料主要有氧化铝、硅胶、硅镁吸附剂等，可以用来萃取极性化合物。反相萃取柱的填料主要有C8、C18、CN（氰丙基键合填料）等，可以用来萃取非极性或弱极性化合物。离子交换柱和吸附树脂柱的填料是带电荷的离子交换吸附剂，主要有NH2、石墨化炭黑、活性炭等，可以用来萃取带电荷的化合物。SPE可分为2 种模式：一种是经典的SPE模式，主要用于吸附目标化合物，这种模式通常包括柱的预处理、样品过柱、洗涤除杂质、干燥、洗脱目标化合物5 个步骤；另一种是杂质吸附模式，样品过SPE柱时杂质被柱填料吸附，而目标化合物通过SPE柱并被收集在容器中。相比于液-液萃取，SPE不仅省去了许多繁杂的步骤，同时也大大加快了分析检测的速度，但因其需要将待测物全部提取出来才可以进行检测，因此SPE所耗时间较长。

3.3.2 QuECHERS

QuECHERS是一种快速、简单、廉价、有效、稳定、安全的样品前处理方法，该方法初期只是为水果、蔬菜及谷物等低脂样品中农药残留检测而建立的一种快速、有效的前处理方法，其原理是利用乙腈萃取样品中的农药残留，氯化钠和无水硫酸镁盐析分层，萃取液经无水硫酸镁和N-丙基乙二胺分散固相萃取净化后，用GC、GC-MS等进行多残留分析[31-33]。鉴于其独特的优势，后期经过大量研究，现在该方法不仅可以检测水分含量高、脂肪含量低的样品，而且能检测水分含量低且脂肪含量较高的样品。该方法发展迅速，在植物源性和动物源性食品农药残留检测中已逐渐成为多残留分析的首选方法。

3.3.3 GPC

GPC的基本原理是选择不同尺寸的惰性多孔凝胶为固定相，当样品通过固定相时，大分子化合物（如色素、油脂、聚合物、生物碱等）受到体积排阻先流出色谱柱，小分子化合物（如污染物和农药等）则渗入固定相微孔中后洗脱出来，样品中各组分按分子大小实现分离[34]。GPC作为一种快速分离大分子类杂质的前处理方法，其缺点是溶剂用量大、净化时间长，优点是可以自动化处理、色谱柱可重复利用、净化效果好。

综上所述，依据目标检测物的理化性质和基质干扰情况选择最合适的前处理方法是开展农药残留检测的必要条件，是保证测量结果质量的关键因素。除此之外，各个前处理方法中均有的关键控制点，如提取溶剂、提取时间等的优化也对测定结果，尤其是测量重复性影响因素有重要影响[35-36]，实验过程中应严格管控。例如，在实验过程中发现：试样用乙腈提取时，氯化钠的加入量与试样是否用水稀释及稀释加水量有关，如婴儿配方乳粉和干酪脂肪含量高，需多加水稀释，则需相应增加氯化钠的加入量，以保证农药被完全提取；冷冻离心时，离心速率太低会导致分层不好，吸取提取液时容易引起误差，针对不同基质必须选择合适的离心速率；净化时每次实验应尽量选用同一批次净化柱，以保证实验重复性；浓缩时，净化后需将洗脱液氮吹近干，然后用溶剂复溶上机，若氮吹温度太高，会使部分农药降解，温度太低又导致实验耗时过长，同时氮气压力也要根据经验找到最佳压力范围，刚开始氮吹时液面较高，若氮气压力太大则容易将提取液吹出氮吹管，从而导致农药含量测定结果降低，因此控制合适的氮吹温度和氮气压力也是保证实验重复性的重要因素。

4 结 语

尽管国家限量标准中生乳中已规定最大残留限量的拟除虫菊酯类农药种类较少，但由于其市场使用量的逐年增加，乳制品行业仍需高度警惕，风险防控不能放松。同时，虽然拟除虫菊酯种类较少，但多数拟除虫菊酯类农药都有同分异构体，检测难度较大，建立精细的高通量样品前处理技术，并结合多种先进的分析仪器，如气相色谱-三重四极杆串联质谱仪、液相色谱-三重四极杆串联质谱仪、电感耦合-等离子质谱仪和飞行时间质谱仪等，将是乳制品中拟除虫菊酯类农药检测方法的发展趋势。