单核细胞抗烟曲霉感染作用的研究进展

莫非，王桂芳

1. 上海健康医学院医学技术学院，上海 201318； 2. 复旦大学附属华山医院呼吸科，上海 200040

曲霉属(Aspergillus)有200余种，包括黑曲霉(Aspergillusniger)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)等。其中烟曲霉是临床上最常见的致病性曲霉，可导致过敏性哮喘、烟曲霉肿和侵袭性烟曲霉病，后者可播散至全身多个器官，肺是主要靶器官，尤其易发生于免疫低下人群。国内流行病学资料显示，在非血液恶性疾病中，肺曲霉病居肺真菌病首位，比例达 37.9%[1]。目前，烟曲霉感染存在早期诊断困难、治疗药物不良反应大及易耐药等问题[2]，临床治疗十分棘手。系列报道表明，正常环境暴露与烟曲霉感染率上升没有必然联系；但接受化疗等免疫力低下人群中烟曲霉感染率明显高于正常人群，表明在人体免疫力正常时烟曲霉难以入侵，免疫低下时易被烟曲霉侵袭[3]。在烟曲霉与机体相互作用中，机体免疫状态是首要因素。前期研究显示，天然免疫在抗烟曲霉感染尤其是早期进程干预中起决定性作用，其中单核细胞的直接杀伤作用仅次于中性粒细胞[4-5],并间接参与抗感染调节，具有早期抵御和诊断价值，颇受关注。本文对近年来有关单核细胞在烟曲霉感染中作用的研究进行综述。

1 烟曲霉的生物学特性

1.1 烟曲霉大小与温度适应性

烟曲霉在自然界中广泛存在，孢子直径2～3 μm，易吸入经气道直达肺泡。其胞壁富含疏水蛋白，易分散于空气中，且在一定湿度范围内变化不大，较其他同等大小的孢子更易被肺泡摄取。烟曲霉孢子最适生长温度为37 ℃，pH 3.7～7.6，但在12～65 ℃和pH 2.1～8.8 环境中仍可分离到烟曲霉孢子。与其他真菌孢子相比，烟曲霉孢子表面存在厚厚的外膜，具有耐热、耐冷冻、耐压力和耐干燥特性。70 ℃处理30 min仍保持活性，在液氮中可存活18年，冻干脱水状态下可存活60年，这种能在超一般温度下生存的机制尚不清楚[3]。Albrecht等分析烟曲霉30～48 ℃的蛋白质组学，发现大多数变化在2 h内已发生，且一些蛋白持续增高，如热休克蛋白。这是否与烟曲霉耐热性直接相关，有待探讨[6]。

1.2 烟曲霉自身组分

烟曲霉细胞壁是与宿主首先接触的成分，在培养条件和环境压力改变时会不断发生变化。烟曲霉细胞壁由β-(1,3)葡聚糖、β-(1,4)葡聚糖、α-(1,3)葡聚糖、几丁质和半乳甘露聚糖组成，其中β-(1,3)葡聚糖和半乳甘露聚糖具有强免疫原性，是重要病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)。β-葡聚糖存在于几乎所有真菌，已用于侵袭性真菌病诊断( G试验)；同时单核细胞通过Dectin-1识别真菌孢子表面β-D-葡聚糖而吞噬真菌孢子[7]。烟曲霉孢子较其他曲霉属孢子表面有较多带负电荷的唾液酸残基存在，更易定植于宿主细胞表面[8]。

烟曲霉细胞壁表面疏水蛋白参与生物膜形成，也与其致病性有关。疏水蛋白RodA在烟曲霉分生孢子表面聚集成有规律的簇状结构，形成表面疏水膜，有助于避开免疫细胞识别[9]。破坏rodA基因导致烟曲霉孢子对胶原蛋白和白蛋白的黏附力下降，敲除该基因后烟曲霉仍具有致病性，但对肺部炎症反应减弱[10]。此外，烟曲霉细胞壁中含有1,8二羟基萘黑色素，呈蓝绿色，可保护孢子抵御紫外线照射[11]。该色素缺失会使烟曲霉产生白色孢子，导致其致病性减弱并对氧化剂更敏感，更易被宿主免疫系统捕获及清除。

1.3 烟曲霉代谢产物

烟曲霉的代谢产物主要是毒素和蛋白酶类，可帮助其适应不同环境和营养需求，与烟曲霉孢子在自然界中的广泛分布有关[3]。其中，对胶霉毒素的研究较多。胶霉毒素被宿主细胞吸收后，通过与靶蛋白形成二硫键，使靶蛋白失活，并通过诱导单核细胞凋亡而抑制宿主免疫应答[12]。小鼠实验提示，感染早期胶霉毒素生物合成活跃，提示胶霉毒素是烟曲霉的重要侵袭因素，同时受损的宿主细胞进一步被蛋白酶利用，为烟曲霉提供能量。烟曲霉产生丰富的糖基化水解酶和胞外蛋白酶，有助于其通过降解宿主细胞的胞壁多糖和蛋白质获取氮源[3,13]。此外，富含特殊功能的酶类也是烟曲霉的优势之一，其中抗氧化系列超氧化物歧化酶和谷胱甘肽转移酶、过氧化氢酶可有效清除活性氧，相应酶基因缺失可导致菌株在免疫低下小鼠模型中致病力降低[7,14]。

2 单核细胞的生物学特性

单核细胞源自骨髓，可分化为树突细胞和组织中的巨噬细胞，也可直接参与抗病原体反应或间接激活细胞毒性T细胞而启动适应性免疫发挥保护作用[15]。近年研究已明确单核细胞及其前体特征[16]。早期研究认为单核细胞亚群包括CD14+CD16-/CD14+CD16+，人类90%的循环单核细胞为CD14+CD16-单核细胞。Serbina等分离了干细胞捐献者的CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞，比较吞噬和抗真菌效果。观察到两个亚群的单核细胞均可有效吞噬烟曲霉孢子，CD14+CD16-亚群烟曲霉孢子发芽伴随少量肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)分泌，相反CD14+CD16+亚群可分泌大量TNF[17]。近年来，根据表面分子表达情况，单核细胞可进一步细分为经典型(CD14++CD16-)、中间型(CD14++CD16+)和非经典型(CD14+CD16++)单核细胞。目前认为，经典型单核细胞吞噬能力最强，中间型单核细胞呈递抗原，非经典型单核细胞作为巡逻细胞参与炎症反应。关于对应型别细胞因子的分泌报道不一，可能与刺激因子和细胞状态不同有关。3种型别单核细胞与成熟度有关，可互相转化，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)可能是重要转录因子[18]。鉴于单核细胞异质性较强，进行分子标记结合形态学观察的综合分析更有必要。人与小鼠单核细胞的同源性较高，很多功能实验借助于小鼠模型观察完成，小鼠CX3CR1intLy6Chi单核细胞亚群中，CD14++CD16-与CD14++CD16+单核细胞亚群具有相似功能，而小鼠CX3CR1hiLy6Clow/-单核细胞亚群则对应人CD14+CD16++单核细胞亚群[19-20]。

3 单核细胞与烟曲霉相互作用

3.1 烟曲霉刺激人单核细胞蛋白表达变化

使用烟曲霉孢子刺激健康人单核细胞，与对照组相比，刺激后单核细胞有超过 1 800 个基因表达[21]；进一步刺激，有超过400个基因单独表达于对烟曲霉孢子有反应的单核细胞，而不表达于脂多糖刺激的单核细胞，提示了单核细胞抗烟曲霉孢子的独特性[22]。Loeffler等设计不同状态孢子与单核细胞共孵育，并动态记录。结果显示，静息、肿胀和萌芽3种状态的孢子3 h内均被摄入。基因芯片显示，伴随孢子萌芽，免疫相关基因表达上调。其中白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)、巨噬细胞炎症蛋白3α(macrophage inflammatory protein 3α，MIP-3α)和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1/CCL2)可能是关键调节因子[23]。将人全血与烟曲霉菌丝共孵育，分离各白细胞亚群，采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测到单核细胞内TNF-α表达增高并依赖血浆组分，用针对表面分子CD14的抗体处理后可抑制TNF-α释放[24]。血浆中单核细胞的协同成分还不清楚，此前有学者体外观察到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)可增强单核细胞抗真菌作用，其中促进超氧离子释放可能是机制之一。通过比对分析单核细胞来源的巨噬细胞中抗烟曲霉感染潜在基因的表达与多态性，发现IL-1和IL-15信号通路在其中有重要作用[25]。

3.2 烟曲霉对人单核细胞凋亡的影响

在机体免疫细胞与病原体相互作用过程中，细胞凋亡颇受关注。体外血清学实验观察到，用烟曲霉胶霉毒素处理后，单核/淋巴细胞比例降低伴随含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)活化，表明该毒素介导单核细胞及单核细胞来源的CD83+树突细胞凋亡而发挥免疫抑制作用[12]。也有研究显示，烟曲霉孢子可通过阻止细胞色素C释放而保护线粒体，发挥凋亡调节作用。烟曲霉是促单核细胞凋亡还是抗凋亡？这一过程如何发展？对机体影响怎样？是不利于抗感染还是有助于机体内环境稳定？德国科学家运用遥感光谱成像技术观察单个凋亡的单核细胞，借助升级版荧光显微镜，动态检测胞内pH值，综合分析色素化孢子对凋亡单核细胞命运的影响。结果发现，黑色素化的烟曲霉孢子可帮助凋亡单核细胞从线粒体酸化状态中恢复[26]，重新开始细胞周期，表明烟曲霉孢子对不同状态细胞有不同作用。推测原因，可能二羟基萘 (dihydroxynaphthalene，DHN)黑色素是很好的电子接受体，可捕获凋亡过程中产生的自由基[27-28]。这种基于经典光谱测量和传统数字图像处理发展起来的遥感光谱成像技术，可详细记录单个样品不同角度的光谱信息，并能实时定量分析，从而用于凋亡机制研究。

3.3 不同烟曲霉株对人单核细胞功能的影响

不同来源的烟曲霉株对人单核细胞氧化应激功能是否有差异？法国学者Pastor等通过平均荧光强度比较不同烟曲霉株对人单核细胞氧化爆发活动的影响，观察7株来源于侵袭性曲霉病患者和11株来源于支气管的定植菌对单核细胞的氧化应激反应。结果未发现侵袭组与定植组有显著差异，但结合序列特异性DNA引物(sequence-specific DNA primer，SSDP)分型方法观察到单核细胞色素缺失株的氧化应激反应与其他非缺失株存在显著差异[29]。该研究表明，烟曲霉入侵结局更侧重于人体免疫状态，可通过研究前向和侧向散射光物理参数进行细胞分类。但鉴于单核细胞群体的较强异质性，细胞分类需更准确定位。

3.4 体内环境模拟尝试

Chandorkar等建立了人支气管和小气道上皮细胞3D动力模型[30]。运用气液相界面(air liquid interphase，ALI)系统培养正常人支气管和小气道上皮细胞，保障上皮细胞生长、纤毛运动和屏障作用。在气流推动下，上皮细胞分化加速，培养稳定后加入单核细胞来源的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)共培养，加入烟曲霉孢子，模拟体内感染。借助不同颜色的荧光染料标记，在激光共聚焦显微镜下结合三维成像技术，研究APC摄取真菌孢子的过程。结果观察到真菌孢子可被巨噬细胞和树突细胞有效捕获，如果没有加入真菌孢子则APC未见活化迹象。该系统运用ALI系统培养原代气道上皮细胞，更好地模拟了体内环境，比传统静态培养体系更有效，但费用较高。

3.5 小鼠单核细胞抗烟曲霉效应

单核细胞体内实验一般以小鼠为研究对象，通过荧光标记、基因敲除等多种手段研究其功能。Jhingran等设计构建FLARE(fluorescentAspergillusreporter)孢子模型，通过两种荧光素分别显示存活和被细胞摄入后的烟曲霉轨迹，观察其与宿主的相互作用[5]。Espinosa等进一步运用限制和抗体介导的细胞缺失策略，研究小鼠体内单核细胞抗真菌的效应，发现以表达细胞表面C-C趋化因子受体2[chemokine (C-C motif) receptor 2，CCR2]为标记的单核细胞可快速集中至炎症部位并产生细胞因子和趋化因子。通过构建基因工程小鼠，与CCR2表达组相比，CCR2缺失组烟曲霉侵袭性感染及中性粒细胞杀孢子活力降低；且CCR2表达组肺部单核细胞及其来源的树突细胞聚集产生TNF、一氧化氮(nitric oxide，NO)和活性氧，展现了快速有效的杀孢子活力，明确了CCR2+单核细胞及其来源的树突细胞在抵御吸入性孢子入侵中的直接和间接作用[4]。

3.6 小鼠单核细胞抗烟曲霉的信号分子

小鼠循环单核细胞主要分Ly6Chi和 Ly6Clo两群，Ly6Chi单核细胞在C-C 趋化因子信号作用下经G蛋白偶联CCR2离开骨髓[31]。Caffrey等通过小鼠实验发现，IL-1α通过IL-1受体Ⅰ型(IL-1 receptor type I，IL-1RI)信号转导促进C-X-C趋化因子配体1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1；也称neutrophil-activating protein 3，NAP-3]表达，伴随白细胞募集因子释放；IL-1RI缺失小鼠则需通过补充细胞因子募集中性粒细胞以增强抗真菌能力。CCR2+单核细胞通过调节IL-1α和 CXCL1表达，在中性粒细胞早期募集中起重要作用，提示IL-1可能是单核细胞抗烟曲霉通路中的重要信号分子[32]。此外，TNF也是CCR2+单核细胞分泌的杀真菌孢子的效应分子[33]。目前认为，TNF在单核细胞介导的抗感染免疫功能中是一把双刃剑，适度分泌可有效抗感染，过度活化则会造成肺组织损伤，不利于远期康复，提示未来研究需关注细胞功能平衡。

4 结语

通过分泌天然免疫分子、促炎细胞因子直接杀伤或调节免疫反应可能是机体单核细胞抗烟曲霉机制的核心。决定单核细胞分化与抵御的关键细胞因子、主要信号通路、与其他细胞间的联系及其在不同免疫状态人群中的功能特征均有待深入研究，以指导临床抗烟曲霉治疗。

天然免疫系统的活化与曲霉种类、形态学特征、生长阶段和环境敏感性等相关。入侵与抵御是一个互动的过程，对生物特性及免疫机制的认识，有助于探讨烟曲霉与人体的相互作用。此外，反应适度很重要：免疫应答弱，难以阻挡烟曲霉入侵；免疫应答过强，超范围的炎症反应造成肺组织损伤也不利于患者康复。在与烟曲霉的相互作用中，免疫平衡是目标，早期抵御是关键。