甲型流感病毒非结构蛋白NS1功能研究进展

刘瑞寒，朱汝南，钱渊

1. 北京协和医学院研究生院首都儿科研究所病毒研究室，北京100730； 2. 首都儿科研究所病毒研究室，儿童病毒病病原学北京市重点实验室, 北京 100020

流感病毒(influenza virus)是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属成员，为有包膜的单股负链分节段RNA病毒[1]。其具有极强的传染性，可引起急性呼吸道传染病。根据病毒颗粒中核蛋白(nucleoprotein，NP)和基质蛋白(matrix protein，M)抗原性的差异，流感病毒可分为甲(A)、乙(B)和丙(C)3种型别。其中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是每年季节性流感的主要病原体，自1918年起在全世界范围引起5次大的病原明确的暴发流行。IAV的非结构蛋白1(non-structural protein 1，NS1)与病毒-宿主相互作用关系最密切，是IAV感染过程中拮抗宿主天然免疫反应的主要病毒成分，也是影响流感病毒致病性和宿主适应性的关键毒力因素[2]。

IAV的NS1是由病毒第8节段RNA编码的多功能调控蛋白，存在于病毒培养上清或被感染的细胞中，但不存在于病毒颗粒中。NS1通常含有215～237个氨基酸，包含两个功能结构域，即N端的RNA结合域(RNA-binding domain，RBD)和C端的效应结构域(effector domain，ED)，两个结构域之间由7～12个氨基酸的连接区(linker region，LR)连接[3]。NS1的功能主要依赖其蛋白-RNA、蛋白-蛋白相互作用，包括抑制干扰素(interferon，IFN)的转录表达；抑制IFN诱导的蛋白激酶R(protein kinase RNA-activated，PKR)和2′，5′寡聚腺苷酸合成酶(2′，5′-oligoadenylate synthetase，OAS)/核糖核酸酶L(ribonuclease L，RNase L)的抗病毒作用；激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路，抑制被感染细胞凋亡；调控病毒RNA合成及病毒RNA剪接，增强病毒蛋白质合成等；与宿主蛋白相互作用，调节病毒生物学特性。因此，深入了解NS1的生物学功能及其不同变异形式对功能的影响，将为设计新型抗病毒药物和减毒疫苗奠定基础。

1 NS1抑制IFN的转录表达

宿主细胞产生IFN是一种可有效限制病毒复制及传播的抗病毒机制。病毒感染细胞后，经自分泌或旁分泌途径产生的IFN可诱导宿主细胞产生300多种具有抗病毒作用的基因表达[4]。IAV的NS1抵抗宿主抗病毒应答效应主要表现在抑制IFN的合成及抑制IFN诱导表达的抗病毒基因ISG(interferon-stimulated gene)激活两方面。这两种功能主要由NS1的C端ED区执行，由于ED区存在多种变异形式，不同毒株的NS1对IFN合成及相关功能的抑制机制不同[5]。在自然环境或实验室传代过程中，NS1可丢失这些机制中的一种或全部。

1.1 NS1抑制IFN基因相关转录活化因子，降低IFN转录

病毒感染宿主细胞时，宿主细胞中的RNA解螺旋酶维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)可识别并结合至细胞内双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)或5′端含有三磷酸基团的单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)，使自身发生ATP依赖的构象改变而暴露其N端CARD结构域(caspase recruiting domain)[6]，后者可被泛素连接酶TRIM25(tripartite motif-containing protein 25)[7]或Riplet/RNF135(RING finger protein 135)[8]泛素化，也可与TRIM25合成的多聚泛素链结合[9]。经泛素化修饰的RIG-Ⅰ CARD随后与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)的CARD结合，激活MAVS并使其发生低聚反应，进而激活其下游的多个激酶信号通路，最终导致细胞质中转录因子如干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)及c-Jun/活化转录因子2(activating transcription factor 2，ATF-2)的磷酸化激活及向胞核内的转运[10]。这些转录活化因子在细胞核内的出现可大大增加IFN的转录表达。H5N1、2009 H1N1 pandemic(H1N1pdm)及2009年以前的部分H1N1亚型流感病毒的NS1，通过与 TRIM25 的卷曲螺旋域相互作用阻止其寡聚化而减少了RIG-Ⅰ的泛素化，进而抑制宿主细胞中IRF3、NF-κB及c-Jun/ATF-2的活化来减少IFN基因的转录[7]。当NS1出现S42P突变时，IAV在细胞培养中的增殖能力降低，不能发挥抑制宿主细胞表达IFN及降低IRF3磷酸化水平的作用[11]。

Kuo等发现，H3N2亚型流感病毒NS1虽然也可有效结合TRIM25，但不能抑制IRF3的激活及IFN的转录起始，表明NS1与TRIM25的结合并不是抑制IRF3激活所必需的[12]，因此NS1与TRIM25结合可能抑制了另外的由TRIM25激活的抗病毒信号通路。Riplet与NS1的结合仅在NS1可抑制IRF3活化的流感病毒亚型中出现，且NS1与Riplet的结合表现出明显的种属限制性，人流感病毒NS1仅能与人类表达的Riplet结合而抑制RIG-Ⅰ的泛素化，不能与猪或禽源Riplet结合[13]。此外，ATP依赖的RNA解螺旋酶LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)也含有与RIG-Ⅰ相似的可识别并结合病毒RNA的结构域，但LGP2缺乏用来激活下游IRF3的可被泛素化的CARD。在无法抑制IRF3激活和IFN合成的H3N2亚型流感病毒感染的细胞中过表达LGP2，发现STAT1转录活化因子的激活受到抑制，且IFN的转录水平明显降低；在可抑制IRF3激活和IFN合成的H1N1亚型流感病毒感染的细胞中过表达LGP2，却没有表现出相同的作用[14]。因此，NS1可抑制IFN基因相关的转录活化因子，减少IFN转录毒株亚型的差异及宿主差异，但具体机制仍不明确，需进一步研究。

1.2 NS1抑制宿主细胞pre-mRNA的加工成熟，减少胞质中IFN翻译模板

剪切和多聚腺苷酸化特异性因子(cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF)的相对分子质量为 30 000 的亚基即CPSF30，具有在细胞核内裂解宿主pre-mRNA并对裂解的pre-mRNA进行聚腺苷酸化的作用，是宿主细胞内pre-mRNA 3′端加工成熟的必要蛋白酶[15]。随后，多聚腺苷酸结合蛋白2 [poly(A)-binding protein 2,PABP2]和poly(A)聚合酶共同对带有10～12个腺苷酸尾的pre-mRNA进行进一步的加A延伸，完成对细胞核内pre-mRNA的加工[16]。NS1可通过以下3种方式抑制宿主细胞pre-mRNA的加工成熟，减少胞质中IFN翻译模板，从而降低被感染细胞中IFN的表达。首先，NS1的ED区与CPSF30的锌指结构F2F3结合，使后者不能与pre-mRNA结合[17]，未加工的pre-mRNA在细胞核中大量聚集，胞质中成熟mRNA大量减少，其中包括IFN及多种具有抗病毒作用蛋白的mRNA[18]；其次，ED区与PABP2结合影响poly(A)延伸，造成pre-mRNA多以10～12个腺苷酸为尾部结构的现象，无法进行核输出而聚集在细胞核内；最后，NS1与PABP2结合也能抑制3′端已完成加工的mRNA的核输出，导致更多的宿主mRNA滞留在细胞核内[16]。

NS1与CPSF30相互作用的区域为第184～188位氨基酸，第184位甘氨酸被精氨酸置换后，NS1与CPSF30的结合能力消失；第187位疏水性色氨酸是ED区形成二聚体的必需氨基酸位点，不直接影响两者的结合，但可通过改变ED的空间构象影响NS1的功能；在两者结合区域外的第103位苯丙氨酸和第106位蛋氨酸虽然不直接参与NS1与CPSF30的结合，但可使NS1与CPSF30的结合更稳定[19]。

不同亚型的流感病毒其NS1与CPSF30的结合抑制pre-mRNA加工成熟的作用也存在差异。H3N2和H2N2亚型流感病毒的NS1虽不能抑制宿主细胞中IRF3等IFN相关转录活化因子的激活，但其与CPSF30结合可抑制IFN pre-mRNA的成熟而减少宿主细胞内IFN的合成[12]。相反，H1N1pdm亚型流感病毒中，前面提到的3个位点的氨基酸均不利于NS1与CPSF30结合，各位点发生相应氨基酸突变后，大大降低了该亚型流感病毒在小鼠体内的致病力及复制能力[20]。1997年，在中国香港地区分离得到的H5N1亚型流感病毒NS1中，第103位和第106位氨基酸分别是亮氨酸和异亮氨酸，将两个位点的氨基酸分别用苯丙氨酸和蛋氨酸替代后，体外细胞培养中病毒的复制能力提高了近20倍[21]。

1.3 NS1的组蛋白模拟功能抑制宿主基因转录

1989年以后分离的H3N2亚型流感病毒NS1的C端第226～229位氨基酸为ARSK序列，该氨基酸序列与组蛋白H3K4的N端ARTK序列相似，因此宿主细胞内的甲基化酶会错误地识别NS1的ARSK序列，且甲基化其最后一位赖氨酸[22]。甲基化修饰后的NS1具有模拟组蛋白的功能，与hPAF1C结合，抑制hPAF1C介导的转录延伸机制，抑制包括抗病毒基因在内的一些诱导表达基因的转录。NS1的C端缺失ARSK序列后，便丧失了该功能。NS1的组蛋白模拟功能抑制基因转录在一定程度上弥补了H3N2亚型流感病毒NS1缺失的通过IRF3途径抑制IFN表达的作用[23]。

2 NS1抑制IFN诱导的PKR和OAS活化

NS1拮抗IFN抗病毒作用除表现在其对IFN转录前及转录后的抑制作用外，还可与IFN诱导表达的ISG产物直接结合，抑制ISG的抗病毒作用。目前研究较多的两种ISG分别是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKR及 RNAse L通路活化的OAS。

2.1 NS1抑制IFN诱导的PKR活化

PKR是一种在哺乳动物细胞中构成性表达并依赖dsRNA的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，IFN会增加其表达水平[24]。PKR可被dsRNA或细胞内PACT(PKR-associated activator)激活，解除PKR的自我抑制使其自身发生磷酸化，随后将包括真核起始因子2(eukaryotic initiation factor 2，eIF2)α亚基(eIF2α)在内的靶蛋白进行磷酸化[25]。磷酸化的eIF2α功能失活，被病毒感染的细胞中所有蛋白的合成均受到抑制，病毒自身蛋白质的合成也受到抑制。但IVA感染细胞中PKR没有表现出激活形式[26]，RBD缺失的NS1毒株感染细胞后PKR依然没有表现出激活的作用，因此研究者推测NS1 ED区可直接结合PKR，以不依赖dsRNA的方式抑制PKR的构象向活化形式改变[27]。Min等则报道，NS1第123～127位氨基酸与PKR的连接区相互作用，抑制了由dsRNA或PACT引起的PKR构象改变[28]。

2.2 NS1抑制IFN诱导的OAS活化

含有2′-5′磷酸二酯基团的寡核苷酸是病毒复制的副产物， OAS可将ATP聚合进入这些副产物，合成2′-5′寡腺苷酸链(2′-5′A)。细胞中的dsRNA可活化OAS，使其发挥在2′-5′磷酸二酯键后加入多聚腺苷酸链的作用。随后2′-5′A可结合并活化细胞中构成性表达的RNase L，后者能裂解病毒及宿主细胞中的ssRNA，从而抑制病毒复制；同时，RIG-Ⅰ可识别并结合经RNase L裂解产生的小片段RNA，进而增加IFN的转录表达，形成对IFN表达的正反馈[29]。流感病毒NS1的RBD与dsRNA的结合能力稍强，可与OAS竞争性结合dsRNA，而抑制OAS/RNase L信号通路激活。当NS1的RBD第38位氨基酸由精氨酸突变为丙氨酸时，丧失了与OAS竞争性结合RNA的能力，病毒复制减少[30]。

3 NS1激活PI3K/Akt信号通路， 抑制病毒感染引起的细胞凋亡

PI3K是一种由相对分子质量分别为 85 000 的调节亚基(p85)和 110 000 的催化亚基(p110)组成的异二聚体脂质激酶[31]。PI3K活化后，可产生 胞内第二信使——三磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP3]，随后PIP3募集胞膜上一系列下游信号蛋白。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt是PIP3结合的PI3K效应器。PI3K/Akt信号通路的激活抑制了凋亡蛋白Caspase-9和调控细胞代谢的GSK-3β的活化，进而抑制细胞的凋亡程序[32]。NS1的ED区与p85β-SH2及p110结合，解除了p85β对p110α的抑制，激活了PI3K/Akt信号通路，抑制了流感病毒感染诱导的细胞凋亡程序，为病毒在宿主细胞内复制提供了有利条件[33]。将第89位保守表达的酪氨酸替换为苯丙氨酸后，NS1失去了与p85β结合及活化PI3K/Akt的能力[34]，细胞被感染后很快进入凋亡程序，不利于流感病毒在细胞中复制。此外，NS1还可与Crk/CrkL的N端SH3结构域结合激活PI3K，进而对Akt进行磷酸化激活，该相互作用需NS1第215位氨基酸为脯氨酸，多见于禽流感病毒[35]。因此，IAV感染宿主细胞时，NS1可在PI3K/Akt信号通路中多环节调节宿主细胞对病毒感染的应答。

4 NS1促进病毒mRNA和蛋白的合成

NS1可使大量宿主pre-mRNA滞留在细胞核内，病毒的帽依赖性内切酶可将宿主pre-mRNA上多腺苷酸帽切下来，作为合成病毒mRNA的引物，促进病毒mRNA的合成[36]。流感病毒感染宿主后，其NS1可特异性识别并结合含有5′-非翻译区(5′-untranslated region，5′-UTR)的病毒mRNA，大量转录病毒mRNA。NS1的N端第81～113位氨基酸可与转录起始因子eIF4GI结合，将eIF4GI募集并结合到病毒mRNA的5′-UTR区以增强病毒mRNA的转录[37]。同时，NS1的N端第81位氨基酸可与PABP1结合，PABP1与eIF4GI有协同作用，三者形成NS1-PABP1-eIF4GI复合物，共同促进病毒mRNA的转录[38]。hStanfen是一种可以与dsRNA及微管蛋白结合的蛋白，通过其微管运输功能将病毒mRNA运输至翻译场所，如多聚核糖体[39]。因此，NS1通过与病毒mRNA 5′-UTR、eIF4GI、PABP1和hStanfen的相互作用，募集病毒mRNA，形成多蛋白的转录起始复合物，增强病毒mRNA的转录。近期有研究发现，NS1还可与DDX21结合，后者是细胞表达的解螺旋酶，可通过结合PB1抑制病毒聚合酶复合体的形成而发挥抑制病毒基因复制的功能，但NS1与DDX21的结合解除了其对病毒复制的抑制作用[40]。

5 NS1 C端PDZ结合基序影响毒株毒力

大规模序列分析发现，禽流感病毒NS1的C端最后4个氨基酸XSXV/XTXV是潜在的PDZ(postsynaptic density protein)结合基序(PDZ-binding motif，PBM)[41]。含PDZ区域的蛋白通过蛋白-蛋白识别模式可整合调控多条信号通路，特异性结合4～5个氨基酸的短的C端短肽类基序，进而结合一系列靶蛋白或将蛋白低聚化形成分支。含PDZ区域的蛋白功能涉及多方面，包括物质运输、定位、分子信号复合物的组装、组织细胞极性、受体结合和下游效应器激活[42]。IAV的NS1可与含PDZ区域的Scribble 和 Dlg1蛋白结合，抑制病毒感染过程中的天然免疫反应[43]。90%的人流感病毒NS1的C端PBM为RSKV/RSEV，而禽流感病毒则为ESEV/EPEV。目前已知的可与禽流感病毒NS1 PBM结合的含PDZ的蛋白质约有30种，但与人流感病毒NS1 PBM结合的含PDZ的蛋白质还未被发现[41]。Jackson等为验证以上两类NS1 PBM的功能差异，利用反向遗传技术将1918 H1N1和高致病性禽流感病毒H5N1的PBM表达于A/WSN/33毒株，发现与野生型A/WSN/33相比，改造后的毒株表现出对小鼠更强的致病性和更高的致死率[44]。

6 NS1与抗病毒药物和减毒活疫苗研制

NS1在拮抗宿主抗病毒反应和促进病毒自身基因转录表达方面均表现出重要作用，成为近年来抗病毒药物及减毒活疫苗研制的主要方向。目前，研究者可通过计算机预测和识别大量来自不同亚型毒株的NS1结构及潜在的化学抑制剂结合位点，同时也有多种方法可检测抑制剂的效果。通过比较不同亚型不同毒株NS1基因和蛋白，研究者发现NS1结合dsRNA的能力是其最保守的功能。Cho等和Maroto等分别用荧光和放射性元素标记RNA，监测在不同抑制剂作用下NS1与RNA结合的能力是否受影响，结果证明EGCG和35S-vNSZ两种化学物质均可有效抑制NS1与dsRNA的结合而发挥各自的抗病毒作用[45-46]。Basu等使用以酵母为基础的表型互补实验，识别酵母中有多个可逆转NS1调控的抑制复制的小分子化学物质[47]。其中一个小分子化合物JJ3297表现出明显的抗病毒活性，允许在表达NS1基因的流感病毒感染的细胞中表达IFN和激活RNase L[48]，但其抗病毒作用是直接抑制病毒感染过程中的NS1功能还是通过其他机制尚无定论。

NS1基因表达完全缺失或表达截短的NS1基因均可使病毒在宿主体内的复制能力降低，但并不影响病毒本身诱发宿主产生强烈的天然免疫反应[49]。这种因NS1表达缺陷而表现为毒力减弱、复制能力降低及免疫反应诱导作用较强的毒株的发现，为通过改造NS基因研制减毒活疫苗的想法提供了理论依据。一系列利用反向遗传技术表达NS1 C端缺失的减毒活疫苗在小鼠、猪、马、禽类、雪貂和猕猴中均表现出良好的保护作用[50]。近期一项禽流感疫苗研究表明，于鼻内接种表达NS1缺陷的减毒活疫苗后再皮下接种灭活疫苗，不仅能增强黏膜抗体反应，升高血清抗体效价，还能增强抗体与异种抗原的交叉反应，提供更好的异源性保护[51]。在 15～50岁健康志愿者中进行NS1表达缺陷疫苗的Ⅰ期临床试验中，该疫苗同样表现出良好的安全性及有效的免疫原性[52]。

7 结语

NS1除与上述宿主细胞表达的蛋白相互作用，亦可与病毒自身表达的多种蛋白相结合，在宿主适应[53]和流感病毒的空气传播[54]过程中发挥不容忽视的作用。针对NS1拮抗宿主抗病毒作用机制的相关研究已持续了十几年，这个相对分子质量仅为 26 000 的小蛋白几乎参与了流感病毒感染宿主细胞的各阶段，因此有必要对NS1进行更深入的系统研究，以期为更好地预防和控制流感病毒传播甚至暴发奠定坚实的基础。