PGG通过激活Nrf2抗氧化通路保护AGEs诱导的系膜细胞损伤※

●童金枝 朱甜甜 徐梦强 金 勇 张红燕 孙 敏

1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloy-β-D-glucose,PGG)是一种多酚类水溶性鞣质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等多种生物学活性，广泛存在于多种药用植物中[1-2]。本实验室前期研究表明PGG可以结合系膜细胞[3]，但是其对系膜细胞损伤的保护机制尚不清楚。

AGEs（advanced glycation end products,AGEs）是由小分子葡萄糖上的醛基和大分子蛋白质上的还原氨基在非酶环境下产生的非常稳定且不可逆晚期糖基化终末产物[2]，糖尿病高血糖状态下，AGEs 产生异常增加并诱导细胞产生一系列级联性的氧化应激反应，是糖尿病及其并发症发生、发展的主要机制[4]。Nrf2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2)信号通路是一条抗氧化通路，其被激活后可启动多种下游靶蛋白如HO-1(hemeoxygenase-1,HO-1)、SOD(Superoxide dismutase,SOD)的表达[5]。这些被激活的靶蛋白可调节机体内氧化还原平衡，使机体从氧化状态恢复到正常水平状态[6]。

本实验将以AGEs 诱导肾小球系膜细胞损伤模型，从Nrf2/HO-1信号通路探讨PGG对小鼠肾小球系膜损伤细胞的保护作用及其机制。

1 材料

1.1 细胞株小鼠肾小球系膜MES 13（mouse mesangial cell）细胞株购自美国ATCC细胞库。

1.2 药物和试剂PGG（纯度≥98%）（批号：BZP1001）购自合肥博美生物科技公司；兔GAPDH多克隆抗体（批号：BA2913）购自博士德生物技术公司、兔Nrf2多克隆抗体(批号：16396-1-AP)、兔Ho-1多克隆抗体（批号：10701-1-AP）、兔Histon-H3 多克隆抗体(批号：17168-1-AP)均购自Proteintech 公司、βactin单克隆抗体（批号：M52007M）购自Abmart公司；MDA(批号：A003-1)和T-SOD（批号：A001-1）测试盒均购自南京建成生物工程研究所；RIPA 蛋白裂解液（批号：P0013B）购自碧云天生物技术公司；双氯荧光黄乙酸乙酯（DCFH-DA）（批号：4091-99-0）购自SIGMA 公司；胰蛋白酶（批号：825J041）购自上海生工；高糖DMEM（批号：AE27193275）培养基购自Hyclone 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：Pro#NCI3225CH）和ECL发光液(批号：Prod#34095）购自Thermo 公司；小牛血清（fetal bovine serume,FBS）（批号：F8240-100）购自Solarbio 公司；牛血清白蛋白（bovine serum alumin,BSA）（批号：NA0332）购自Bomei公司，其余均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器低温离心机（Centrifuge 5417R）德国eppendorf）；低速离心机（SC-04）安徽中科中佳科学仪器有限公司；SynergyH1 全功能酶标仪，美国Biotek仪器有限公司；5100B 可见紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；摇床（TS-1），海门市其林贝尔仪器制造有限公司；JS-1070P化学发光成像系统，上海培清科技有限公司；电转模仪及电泳仪装置，上海天能科技有限公司；二氧化碳培养箱（CO-150），美国New Brunswick Scientific CO.,lnc。

2 方法

2.1 AGEs 制备将20mM 葡萄糖和40%BSA 溶于0.15mol/L磷酸盐缓冲液中，37°C 避光孵育8周，用时用培养基稀释至所需浓度。

2.2 PGG 制备将PGG 溶于DMSO 中使其终浓度为20mM 的母液，再用PBS 稀释为400μM 的工作液使用。

2.3 实验分组及药物处理用含有10%FBS 高糖DMEM 培养细胞，将其置于37℃含5%CO2 的恒温培养箱中培养。0.25%胰酶-EDTA消化传代，接种到细胞培养瓶中用于实验。选取状态良好，融合至80%左右的细胞用于实验，实验分为五组。正常对照组(Ctrl)：含10%FBS DMEM 培养48h；模型组(AGEs)：含终浓度为30μg/ml 的AGEs 的DMEM 培养基培养；给药组：含终浓度为30μg/ml 的AGEs 的DMEM 培养基中分别加入终浓度为分别为5μM (PGG-L)、10μM(PGG-M)、和20μM的PGG(PGG-H)，细胞共培养48h。

2.4 指标检测

2.4.1 细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量测定[3]MES(150μL 含5×103)接种于96 孔板中，细胞贴壁后，去上清加不同浓度PGG 处理，每组设3个复孔。24h后，弃去培养基，将培养板用预冷的PBS洗涤三次，并在含有DCFH-DA（10μM）的DMEM(不含酚红)中温育30min，然后用预冷的PBS洗涤细胞并用不含酚红的100μLDMEM 覆盖。置酶标仪于激发光485nm发射光530nm检测荧光强度。

2.4.2 MDA 含量和SOD 活力测定 MES 以1.8×104个密度接种于24 孔板中，细胞贴壁后加不同浓度的PGG 处理。24h 后，吸取细胞培养上清，按照说明书检测MDA含量和SOD活力。

2.4.3 分离细胞浆和细胞核[7]细胞按照上述方法分组处理后，用冰PBS 洗三次，收集细胞，200g 离心3min，弃上清加冷PBS，200g 离心10min，加低渗Buffer[含10mMHEPES（pH7.8）、10mM KCL、2mMMgCl、0.1mMEDTA、10mM Na2P2O4、1mM NaF、10mM β-glycerephosphate、3mMPMSF]，室温2min 冰上10min，加10%NP-40手指轻弹，500g离心5min，取80%上清即为胞浆蛋白；弃去剩下20%上清，用含10%NP-40的低渗Buffer 将底部沉淀（含少量胞浆的细胞核）洗三遍，加 入 高 盐Buffer[ 含50mMHepes、50mMKCl（pH7.4）、300mMNaCl、0.1mM EDTA、10%(V/V)甘油、10mM Na4P2O4、1mM NaF、10mM β-甘油磷酸、3mM PMSF]，并置于液氮中反复冻融三次，置冰上20min，20000g离心20min，取上清即为胞核蛋白。胞浆和胞核蛋白分别用BCA 试剂盒检测蛋白含量，蛋白含量调一致。

2.4.4 Western blot 法检测蛋白的表达 细胞按照上述方法分组处理后，冰PBS 洗三次，收集细胞，3000r/min 离心3min，弃去上清，加入适量RIPA 裂解液，置于冰上，超声裂解提取蛋白，12000r/min 离心20min，保留上清，BCA 法测定蛋白浓度，将蛋白浓度调节一致，加入上样缓冲液，加热煮沸5min，制成样品。样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白电转移至NC 膜，0.5%脱脂牛奶封闭1h，PBST 洗三次，一抗4℃冰箱孵育过夜，再用PBST 洗三次，室温二抗孵育2h，PBST 洗三次，ECL 显色液，JS-1070P 化学发光成像系统拍照保存，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

2.4.5 统计学分析 采用GraphPadPrism5.0统计软件进行数据分析。数据以平均值±标准误（χ±SE）表示各组之间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行检验，P＜0.05认为有显著性差异。

3 结果

3.1 AGEs 对Nrf2、HO-1 蛋白表达时效关系结果如图1 所示，与0h 比较，AGEs 刺激2-6hMES 细胞中Nrf2、HO-1 蛋白表达量增加，12-72hMES 细胞中Nrf2、HO-1表达水平逐渐降低。AGEs孵育48h，MES细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达量较对照组显著下降，且趋于稳定，因此选用AGEs 处理48h 作为实验模型组。

图1 AGEs不同处理时间段对MES细胞中Nrf2和HO-1表达的影响

3.2 PGG对AGEs刺激的MES全细胞中Nrf2及HO-1蛋白表达的影响结果如图2 所示，与Ctrl 组相比较，模型组Nrf2、HO-1蛋白表达量显著下降（P＜0.001，P＜0.05）。与AGEs组相比较，5、10、20μMPGG组Nrf2 蛋白表达量呈现剂量依赖式增加，差异具有显著性意义(P＜0.05，P＜0.001)，表明一定范围内PGG浓度越高，Nrf2 蛋白表达量越高。5、10μM PGG 组HO-1蛋白表达量较AGEs组相比增加但差异并无显著性意义（P＞0.05），而20μM PGG 组HO-1 蛋白表达量较AGEs组显著增加(P＜0.01)。

图2 PGG对MES全细胞中Nrf2及HO-1蛋白表达的影响

3.3 PGG 对AGEs 孵育MES 细胞胞浆和胞核中Nrf2蛋白表达的影响结果如图3所示，与Ctrl组相比，模型组胞浆、胞核中Nrf2 表达量均显著降低（P＜0.05），5、10μM PGG 剂量组Nrf2 蛋白表达略有降低，但无显著性意义（P＞0.05），二20μM PGG组Nrf2表达较模型组显著升高（P＜0.05）；5、10、20μM PGG 处理使细胞核中Nrf2 蛋白表达量显著增加，且呈剂量依赖方式。

图3 PGG对MES胞浆及胞核中Nrf2蛋白表达的影响

3.4 PGG 对AGEs 刺 激 的MES 细 胞 中ROS、MDA、SOD的影响与Ctrl组相比较，模型组ROS含量极显著升高（P＜0.001），MDA 含量显著升高（P＜0.05），SOD 含量显著降低（P＜0.001）。与模型组相比，ROS 和MDA 含量均随PGG 浓度增加而逐渐降低（P＜0.001）；SOD 活力随PGG 浓度增加而升高，其中5μM PGG 组较与模型组比较无明显差异（P＞0.05），而10、20μM PGG 组SOD 活力显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。数据见表1。

表1 PGG对细胞中ROS、MDA、SOD表达水平的影响（χ±s，n=3）

4 讨论

糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要并发症之一，是导致肾衰竭及终末期糖尿病发展的主要原因，严重威胁人类生命健康安全[8-9]。诱发糖尿病肾病的因素多种，高血糖诱导的细胞损伤及功能障碍是主要因素[8]，氧化应激是引发糖尿病肾病的根本原因。许多证据表明，在糖尿病发病机制中氧化应激起核心作用[13]。细胞在高糖和AGEs状态下产生氧化应激反应，引起大量细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生，导致细胞损伤。研究表明，具有强抗氧化性的白藜芦醇可以显著抵抗糖尿病肾纤维化进展，从而抑制DN 的发展，其机制是激活Nrf2抗氧化信号通路，猝灭由AGEs诱导产生的ROS，进而达到保护细胞、减缓DN发展的作用[14]。

细胞内有氧化系统及抗氧化系统，氧化系统可产生大量活性氧自由基，导致细胞损伤。为了抵抗和清除细胞内过量的氧自由基，机体建立了一个独立完整的防御系统，即抗氧化系统，抗氧化系统不仅可以保护细胞免受自由基带来的伤害还能有效抑制脂质过氧化反应。抗氧化系统与氧化系统之间的不平衡可能导致脂质过氧化、蛋白质修饰和DNA损伤，进而引发细胞损伤及功能障碍[15]。Nrf2 是细胞内抗氧化系统中的调节因子，调控许多Ⅱ相代谢酶及抗氧化基因的表达以维持体内平衡[16]。基因敲除法已证明了其通用的细胞保护特征，正常情况下Nrf2 和Keap1 (kelch-like ECH-associated protein-1)结合以非活性状态存在于胞浆中且转录活性较低，当细胞受到ROS 或其他有害刺激后，Nrf2 发生磷酸化，致使Nrf2与Keap1解偶联，Nrf2以非活性状态转变为活性状态，由胞浆进入胞核，与核内抗氧化原件(antioxidant response elements,ARE) 结合，启动下游多种靶蛋白的表达。这些靶蛋白能在被激活后调节机体内氧化还原平衡，使机体从氧化应激状态恢复到正常的生理状态[6]。Xie 等[17]研究发现，鼠尾草酸(carnosic acid,CA)作用于AGEs诱导的系膜细胞氧化应激损伤模型，发现CA组胞浆中Nrf2下降，胞核中Nrf2增加，且HO-1 表达水平升高，炎症因子下调。Kim 等[18]研究发现，葛根素通过激活Nrf2，进而促进HO-1 的表达，从而降低AGEs 刺激小鼠系膜细胞引起的炎症损伤。

Nrf2 在AGEs 诱导的炎症中起作用，它可上调细胞血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表达，从而保护细胞免受炎症损伤[14]。HO-1是Nrf2调节的Ⅱ相解毒酶之一，由它引起的下级信号通路具有抗氧化应激的保护作用。上调的HO-1 可将血红素降解成胆绿素、CO和Fe2+，CO作为NF-kB途径的抑制剂，导致促炎症细胞因子表达量降低，而胆红素也作为抗氧化剂。此外，HO-1直接抑制促炎症细胞因子以及激活抗炎细胞因子，使炎症过程达到平衡[19]。SOD是受Nrf2调控的抗氧化蛋白酶，属于一种金属酶，是机体内氧自由基的头号杀手。SOD 通过歧化反应将超氧自由基转变为H2O2和H2O，H2O2在过氧化氢酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GS-Px)作用下生成H2O，从而保护细胞免受氧化应激损伤[6]。研究证实，MDA是氧自由基ROS攻击生物膜中不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用而形成的脂质过氧化物，其含量的升高会进一步引发氧自由基ROS 的产生[13]，因此MDA 的含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反应细胞的损伤程度，SOD活力的升高将引起MDA含量的下降。激活Nrf2下游抗氧化蛋白如HO-1、SOD 的表达，可降低ROS、MDA 产生并减少氧化损伤，发挥抗氧化保护细胞的作用。Nrf2 抗氧化信号通路对DN 起着重要保护作用，增强Nrf2 抗氧化通路途径可缓解DN 的发展[8,20]。Zheng[12]等研究发现，Nrf2的活化不仅可以改善STZ诱导的糖尿病模型中的代谢紊乱，还可以减少高葡萄糖介导的系膜细胞外基质积累及ROS 产生，从而达到治疗DN的作用。

本实验结果表明PGG 能增加细胞中Nrf2、HO-1的表达，促进Nrf2 向细胞核中转移，降低氧化应激。提示PGG 通过激活Nrf2/HO-1 抗氧化信号通路保护系膜细胞损伤。