调治天癸方对不育症模型大鼠睾丸组织病理形态的观察※
2019-12-20袁轶峰朱文雄陈其华贺菊乔
●袁轶峰 朱文雄 沈 磊 刘 涛 陈其华 周 兴 贺菊乔
近年来,随着人们生活水平的普遍提高,传统的生活方式发生了较大的改变,诸如生活节奏越来越快,工作压力、心理压力越来越大,精神压抑、暴饮暴食、长期熬夜等,使得男性生殖能力下降[1],男性不育症的发病率逐年提高[2],精子质量越来越差,导致男性不育症的病因日趋复杂化[3]。如何有效提高男性生殖能力,提高精子活力成为当下关注的焦点。目前,现代医学治疗不育症的研究仍集中于人工授精、试管婴儿等辅助生殖技术及感染、梗阻等方面,临床尚无解决不育症的根本办法[4]。中药治疗不育症历史悠久,具有创伤小、毒副作用少、效果明显等优点[5]。我院国家级名老中医贺菊乔教授根据多年治疗男性不育症的临床经验,制定出效验方药——调治天癸方。通过前期研究及临床实践积累,发现调治天癸方能改善男性不育症,疗效确切,但具体作用机制不明确。本实验观察调治天癸方对不育症模型大鼠睾丸病理组织的影响以探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物具有生育能力SPF 级健康成年雄性Wistar 大鼠72 只,1.5 月龄,体重(160~200)g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号:SCXK-(京)2018-2019。
1.2 药品调治天癸方,药由酒炙黄芪、酒炙黄精、盐炒菟丝子、枸杞子、炒车前子、熟地黄、酒萸肉、紫河车等组成。由湖南中医药大学第一附属医院中药房统一提供,并由湖南中医药大学第一附属医院煎药房统一熬制成0.16g/mL 浓度的药液。生精胶囊,由遵义廖元和堂药业有限公司提供,国药准字Z20027672,规格:0.4g/粒,产品批号20170905。
1.3 主要试剂及仪器腺嘌呤、0.9%生理盐水、波因氏固定液:购自长沙市化学试剂公司;不锈钢三用电热恒温水箱,购自北京东霞科学仪器厂;隔水式恒温培养箱,购自上海一恒科技有限公司;BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统,购自麦克奥迪实业集团有限公司。
2 实验方法
2.1 动物分组及给药72 只大鼠适应性饲养1 周后,按体重随机分为6组,每组12只,即模型对照组、正常对照组、调治天癸方大剂量组、调治天癸方中剂量组、调治天癸方小剂量组、生精胶囊组。除正常对照组外,其余5组均按文献[6]腺嘌呤改进法造模:将腺嘌呤按500mg/mL浓度配置,并加入与腺嘌呤1:10比例的阿拉伯胶助溶,以5mL/100g/d 剂量连续灌胃10天,一次性成功。造模结束后,停止腺嘌呤灌胃,开始调治天癸方灌胃治疗。正常对照组与模型对照组用等量生理盐水灌胃治疗,按人与大鼠等效剂量换算[10],调治天癸方组分别每日用大剂量组(2.24g/100g)、中剂量组(1.12g/100g)、小剂量组(0.56g/100g)天癸方灌胃。生精胶囊组每日用(0.48/100g)生精胶囊灌胃,连续灌胃48天。
2.2 标本采集实验结束后各组雄性大鼠采用颈椎脱位处死。处死后解剖摘取雄性大鼠睾丸、附睾,观察外观形态并称重。摘取所有雄性大鼠睾丸,用波音(Bouin)氏固定液固定,睾丸固定时持续灌流,石蜡包埋,HE染色[7-9],切片、封片,进行睾组织学观察。
3 统计学方法
采用SPSS 21.0 统计软件进行统计分析,多组比较采用单因素方差分析,方差齐性用LSD、S-N-K 检验,方差不齐采用秩和检验。P<0.01 为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 大鼠一般情况观察实验前各组大鼠活动自如、反应灵敏、状态良好、毛色润泽光滑。造模期间各组大鼠排尿量逐渐增加,并随剂量加大而加重。造模后除正常对照组较实验前无明显改变外,其余各组均表现为不同程度的活动减少、反应迟钝、抱团取暖、食欲减退、饮水量增加,毛色枯槁等表现;“天癸方”灌胃开始到实验结束,正常对照组与实验前无明显变化,天癸方大、中、小剂量组较造模期均有所好转,中剂量组改善最为明显。
4.2 大鼠性腺与模型对照组相比,正常对照组、生精胶囊组、大、中、小剂量治疗组的睾丸质量有显著性差别(P<0.01);与正常对照组相比调治天癸方大、中、小剂量治疗组睾丸质量无显著性差别(P>0.05)。
表1 各组大鼠睾丸、附睾重量比较()
表1 各组大鼠睾丸、附睾重量比较()
注:与正常对照组比较,*P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.01。
4.3 大鼠睾丸组织HE染色各组大鼠睾丸组织切片,HE染色光镜显示:正常对照组大鼠睾丸生精上皮完整、各级生精细胞排列规则,血管丰富,生精小管腔均可见大量成熟精子,生精小管间间质无充血水肿,无炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生(图1A);模型对照组睾丸生精上皮变薄、变形、部分生精小管管腔阻塞或塌陷,生精细胞排列紊乱,大部分曲细精管发生退化、变性、各级生精细胞变性,数量减少细胞间隙增大,支持细胞连接变宽,间质水肿、轮廓不清(图1B);生精胶囊组和调治天癸方各剂量治疗组治疗后(如图1CDEF)生精小管基膜轮廓变得完整清晰,基膜基本完整,管壁厚而圆,管腔内生精细胞的层次增多,排列也趋于条状,生精小管管腔中由精子细胞变态发育为精子的数量相对模型组大鼠显著增多,间质细胞成群分布于生精小管之间的疏松结缔组织内。
图1 200倍镜下各组睾丸组织
5 讨论
男性不育症在我国早有记载,其在古代被称为“无嗣”“不男”“男子艰嗣”“无子”“绝育”等。中医药治疗不育具有悠久的历史,尤其对男性不育的生理特点、病因病理、辨证施治等方面都有丰富的记载[11]。但由于封建思想及失传等历史原因,尚未形成系统的独立专科。近年来男性不育治疗的研究集中于显微外科及辅助生殖技术方面,在药物治疗上方兴未艾。中药治疗不育有确切疗效,但当前传统医学在此领域的理论基础尚不完善[12-13]。调治天癸方是由国家级名老中医贺菊乔教授根据中医肾-天癸-肾子轴的理论,结合多年临床实践总结得出来的治疗男性不育症的方剂。全方由黄芪、黄精、菟丝子、枸杞子、车前子、熟地黄、山茱萸、紫河车8 味中药组成。方中黄芪甘、温,用于补中生气;黄精味甘、平,健脾益气,填精生髓;菟丝子辛甘、微温,滋补肝肾,肝肾为生殖之本;枸杞子味甘平,补肾阴而生肾精;山茱萸理肝肾;紫河车大补元气。诸药调和,填精益肾,共同作用治疗男性不育症。但具体作用效果及机制尚不明确。其改善精子质量的作用机制尚不明晰,特别是对睾丸精子发生微环境等方面的研究尚不够深入。
本实验通过腺嘌呤法成功复制大鼠不育症模型。并随着腺嘌呤给药时间延长,模型对照组大鼠与正常对照组相比明显出现反应迟钝、抱团取暖、小便增多,类似中医肾阳虚的症状和体征。调治天癸方各组在用药48天后,大鼠活动度、反应灵敏度均有提高,且以中剂量组改善效果最为显著,提示调治天癸方能改善不育症模型大鼠的一般情况。调治天癸方各剂量治疗组睾丸质量均显著增加,与模型对照组相比,存在差异显著性(P<0.01)。本实验睾丸组织病理学形态观察结果显示:调治天癸方各组病理改变均轻于模型对照组,生精小管基膜轮廓变得完整清晰,基膜基本完整,管壁厚而圆,管腔内生精细胞的层次增多,排列也趋于条状,生精小管管腔中由精子细胞变态发育为精子的数量相对模型组大鼠显著增多。提示调治天癸方可增加睾丸质量、促进睾丸生精上皮的恢复、促进生殖细胞分化为成熟的精子[14]、减轻生精小管间质水肿,最终改善性腺器官的形态结构,从而改善睾丸生精功能,提高生殖能力。生精细胞、间质细胞及和支持细胞三种细胞主要维持睾丸的生理功能[15-16]。睾丸的生殖功能主要依赖于间质细胞和支持细胞辅助生精细胞生成精子。
综上所述,调治天癸方可明显改善不育症大鼠的生精环境,提高其生殖功能。其机制可能为促进睾丸生精上皮的恢复[17]、促进生殖细胞分化、减轻生精小管间质水肿,并最终改善性腺器官的形态结构,为精子的成熟提供良好的环境。