驴腹泻源大肠杆菌的耐药性分析

王国艳，李燕平，孙乐天，王志宇，牛晓燕，任克良

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2.太原动物园，山西太原030009）

大肠杆菌广泛存在于自然界中，是条件致病菌，通常情况下作为肠道常在菌被人们所知，但是在环境、饲料、水源、热等应激条件下，可引起畜禽肠道病变，诱发腹泻[1-4]等疾病，给畜牧业带来一定的损失。

2018 年11 月初，山西省太原市娄烦县某驴养殖场暴发急性腹泻，临床上表现为卧地不起、精神萎靡、食欲不振、软便[3-5]，发病1 d，无死亡。

本研究对山西省太原市娄烦县某驴养殖场的26 头腹泻驴的粪样进行了细菌分离培养，共分离出26 株大肠杆菌，采用K-B 纸片法对分离菌株进行敏感药物筛选试验，旨在为该驴场临床用药提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 山西省太原市娄烦县某驴养殖场26 头腹泻驴的肛拭子26 份，在无菌实验室进行微生物细菌的分离纯化培养。

1.1.2 试验试剂 生化试验管：乳糖、麦芽糖等各类糖发酵管、尿素、V-P 试验生化管、甘露醇、吲哚试验生化管等，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；培养基：普通营养琼脂培养基、普通肉汤以及鉴别培养基（麦康凯和伊红美蓝），均购自青岛宾得生物技术有限公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.1.3 试验设备 奥林巴斯显微镜、灭菌压力锅、恒温培养箱、超净操作台、数显气浴恒温振荡器。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离鉴定 在无菌环境中，将采集的棉拭子管中分别加入5 mL 的肉汤培养液，37 ℃温箱过夜培养，观察肉汤浊度；再划线接种于普通营养琼脂培养基上，24 h 后，挑取单个菌落接种于麦康凯上，24 h 后，再挑取单个粉红色菌落接种于伊红美蓝平板上，37 ℃培养18～24 h；挑取伊红美蓝上的疑似单个菌落，接种在LB 肉汤中，37 ℃培养18～24 h，备用；蘸取肉汤液，划线接种于伊红美蓝上，恒温37 ℃过夜培养，取单个菌落进行染色镜检。

1.2.2 细菌生化试验 用接种针分别蘸取肉汤菌液穿刺接种于甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、尿素、V-P 试验、吲哚试验等生化管中，恒温37 ℃培养18～36 h。

1.2.3 耐药性试验 采用K-B 纸片扩散法对青霉素、链霉素，头孢类药物头孢克罗、头孢曲松、头孢哌酮，阿米卡星、诺氟沙星、多黏菌素B、痢特灵、卡那霉素、氧氟沙星、庆大霉素、阿莫西林等13 种药物进行药敏试验，37 ℃培养18～24 h 后量取抑菌圈直径，计算耐药率。

2 结果与分析

2.1 疑似病原菌的分离鉴定结果

肉汤管中呈浑浊且有沉淀；在普通琼脂平板生长的单个菌落以乳白色光滑菌落生长；麦康凯平板上有单个菌落呈粉红色或砖红色不透明的光滑的圆形菌落生长；伊红美蓝平板上有单个菌落呈深紫黑色生长。革兰氏染色镜检可见两端钝圆、较细的、单个排列的杆状菌，符合大肠杆菌的培养特性，初步共分离出疑似大肠杆菌菌株26 株。

2.2 细菌的生化试验结果

26 株分离株均发酵甘露醇、乳糖、麦芽糖等糖类，且均产酸不产气，不分解尿素，V-P 试验均为阴性，吲哚试验均为阳性，鉴定均为大肠杆菌，符合《伯杰细菌鉴定手册》中报道的大肠杆菌生化特性。

2.3 药物敏感试验结果

表1 26 株驴腹泻源大肠杆菌对13 种药物的耐药情况

依据美国NCCLS 制定的标准判断，即抑菌圈直径（mm）≥20 mm为高度敏感，16 mm＜直径＜20 mm为中度敏感，直径≤16 mm 为耐药。敏感药物筛选结果显示，分离的26 株驴腹泻源大肠杆菌对青霉素和多黏菌素B 的耐药率高达95%以上，对青霉素更是达到了完全绝对耐药；对痢特灵和头孢克罗的耐药率分别为38.46%和23.08%；对卡那霉素的耐药率较低，为3.85%；对氧氟沙星、诺氟沙星、头孢曲松绝对高敏（表1）。

3 结论与讨论

本研究初步认定，试验分离出26 株驴腹泻源大肠杆菌，分离率为100%，而大肠杆菌被认为是引起畜禽腹泻的主要病原菌之一，推测其是引起该驴场腹泻的优势菌株。

本研究表明，分离出的26 株大肠杆菌除了对多黏菌素B 的耐药率高达96.51%，这与孙莹慧等[6]报道的2017 年分离得到的不明地区的驴内脏型大肠杆菌仅对多黏菌素B 敏感和李双双等[7]在2013 年报道的兔源大肠杆菌对多黏菌素B 的高敏相反，这可能因菌株出现的年代、区域不同，而存在差异，也可能与菌株分离得到的部位有关，内脏型[8]大肠杆菌与肠道型大肠杆菌的差异性有待研究；对青霉素的绝对耐药，与张莉莉等[9]报道的2016 年甘肃部分地区奶牛乳房炎源大肠杆菌对青霉素的耐药率在99%以上相近，与王礼伟等[10]对新疆石河子地区的奶牛乳房炎源大肠杆菌耐药研究中对青霉素完全耐药相同，这可能与青霉素在养殖业中长期不规范使用有关，与地域、菌株分离部位无关；对卡那霉素的耐药率较低，为3.85%，这与王国艳等[11]2018 年报道的山西省兔腹泻源大肠杆菌对卡那霉素的耐药率几乎相同，这表明2018 年山西地区驴和兔的腹泻源大肠杆菌对卡那霉素的耐药性几乎相同，说明同一地区、同一年度、同一饲养规模程度的不同物种，腹泻源大肠杆菌对卡那霉素的耐药性相同。兔和驴都属于特种养殖，在山西地区属于养殖起步阶段；驴腹泻源大肠杆菌对阿米卡星的耐药率为0，这与王志宇等[12]报道的山西省鸡源内脏型大肠杆菌对阿米卡星的高耐药率不同，这表明在不同养殖规模、不同养殖发展程度的养殖过程中，不同来源的大肠杆菌对同一药物的耐药性不同。

大肠杆菌的致病机制和耐药机制比较复杂[13-15]，因地域、时间、来源的不同而存在一定的差异，本研究结果仅对该驴场此次疫病临床用药有指导意义，不具有广泛代表性。