和厚朴酚通过抑制cyclin D1 影响Hep3B 细胞增殖和周期

黄赟 李智文 黄晅昱 刘晨

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是具有高侵袭性的恶性肿瘤之一，术后生存率低，复发率高，5年生存率小于20%[1-2]。目前，手术切除、放疗和化疗仍是治疗肝癌的主要方法。然而在过去的十余年中， HCC患者的生存率仍未见有效提高。因此，开发新的治疗肝HCC的有效药物具有十分重要的意义。和厚朴酚（honokiol，HNK）是厚朴的主要活性成分之一，具有多种药理作用，如抗病毒、抗菌、抗炎、抗衰老、抗氧化、免疫调节和神经保护等作用[3-5]。越来越多研究表明，HNK具有广泛的抗肿瘤活性作用[6-8]。然而，关于HNK对HCC的抗肿瘤作用，尤其是涉及体内实验方面的研究还很少。在本研究中，我们通过研究HNK对正常肝细胞和肝癌细胞间毒性的差异，以及探讨HNK对人肝癌细胞株Hep3B在体外和体内的增殖影响，从而明确HNK是否有抗肝细胞癌的作用。进一步的机制研究中，我们试图寻找合适的分子机制来解释上述功能变化。本研究探索了HNK在HCC治疗中可能的作用机制，为HNK进一步应用于肝癌的临床治疗提供了参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

抗细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、p53、p27、p21抗体均购自美国CellSignaling Technology公司。抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自美国Proteintech公司。细胞周期检测试剂盒（流式）购自北京碧云天生物技术公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）试剂盒和二甲基亚砜购自美国Sigma公司。草酸铵结晶紫染色液购自北京索莱宝公司。

1.2 细胞培养

永生化人肝细胞LO2和人肝癌Hep3B细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞常规培养在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中。当细胞生长至70%左右密度时先更换为无血清培养基，再给予药物处理。

1.3 实验动物及动物模型建立

4 ～ 5周龄的雌性裸鼠（BALB/C-nu/nu；18 ～ 20 g）由上海实验动物中心提供，均饲养在福建医科大学动物实验中心SPF级动物房，实验方案经福建医科大学动物实验伦理委员会批准。Hep3B细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立方法如下：将Hep3B细胞调整密度为2.0×106重悬于100 mL无血清DMEM中并接种在裸鼠的左下腹来构建皮下肿瘤模型。注射10天后可观察到肿瘤时，将裸鼠随机分为2组，每组5只，治疗组每日腹腔注射50 mg/kg 和厚朴酚，对照组为相同体积的溶剂腹腔注射，持续3周。3周后处死并收集肿瘤，并在固定前测量肿瘤重量和体积。肿瘤体积计算方法：测量长径a（cm）和短径b（cm），肿瘤体积V （cm3）=a×b2/2。

1.4 细胞存活率及增殖能力检测

采用MTT法测试Hep3B细胞的存活率和增殖情况。将细胞以特定密度（1 500个细胞/孔用于测定增殖活力；5 000个细胞/孔用于测定存活率）植入96孔板中并培养1 ～ 2天。在HNK刺激后，在每个孔中加入20 μL MTT（5 mg / mL）。孵育4小时后，除去含有MTT的培养基，并向每个孔中加入150 μL 二甲基亚砜。在490 nm波长下测量每个孔的光密度值（OD）。每个实验使用10个复孔。

1.5 平板克隆形成实验

细胞以200个/孔的密度种植于6孔培养板上。培养14天后，用PBS洗涤细胞两次，并用2.0%结晶紫（购自中国北京Solarbio公司）染色。使用显微镜对细胞克隆团进行计数，并确保每个细胞团均含有50个以上细胞。

1.6 流式细胞术分析细胞周期

使用细胞周期检测试剂盒进行细胞周期分析。收集培养的细胞，消化后固定于70%冰冷乙醇中，并在4℃下储存过夜。之后通过离心（1 000×g，5分钟）除去乙醇，然后用荧光染料碘化丙啶（PI）和RNase A在37℃、避光条件下染色30分钟。最后使用流式细胞术分析细胞周期。

1.7 Western blot法检测蛋白水平

4℃条件下在细胞中加入蛋白裂解液，30分钟后收集细胞裂解液，超声碎裂细胞，离心（12 000×g，4℃，15分钟）后测定蛋白浓度，剩余样品混合上样缓冲液并置于100℃中变性5分钟。配置10% 的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离蛋白后转移PVDF膜上，用相应一抗进行孵育（GAPDH稀释浓度为1:2 000，其余抗体均为1:1 000），TBST洗涤后用相应二抗孵育，化学发光法进行显影并进行灰度测定及统计。

1.8 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，所有数据均采用（表示。计量资料比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNK对Hep3B及LO2细胞活力的影响

我们将两种细胞置于不同浓度HNK或不同刺激时间下进行培养，并使用MTT测定法观察两种细胞存活率。结果显示，HNK对Hep3B细胞具有显着的细胞毒性，且有明显的时间-浓度依赖性，50%抑制浓度（IC50）为（22.9±3.4）μM（见图1）。然而，在相同浓度或者时间的HNK刺激下，永生化人肝细胞LO2的存活率没有受到显着影响（IC50＞40 μM）。该结果表明HNK对HCC细胞具有一定的细胞毒作用。

2.2 HNK在体外实验中对Hep3B细胞增殖能力的影响

MTT实验（见图2A）显示随着HNK刺激浓度的增加，Hep3B细胞增殖曲线逐渐趋于平缓，表明HNK降低了Hep3B细胞的增殖速度具有浓度依赖性。平板克隆形成实验（见图2B）结果显示随着HNK刺激浓度的增加，细胞聚落形成数量成显著下降（0 μM：（54.0±6.8）个；20 μM：（18.0±2.4）个；30 μM ：（5.0±1.7）个；0 μM：20 μM，P=0.016；0 μM：30 μM， P=0.009；20 μM：30 μM，P=0.034）。

2.3 HNK对Hep3B细胞周期的影响

与对照组相比，HNK治疗组（30 μM，24 h）中处于G1期细胞数目升高[（51.4±2.21）% vs.（62.2±3.74）%，P=0.023]，处于S期细胞数目下降[（32.4±1.81）% vs.（24.2±1.54）%，P=0.026]，Hep3B细胞从G1期向S期的细胞周期转化受到抑制（见图3 ）。

2.3 HNK在体内实验中对 Hep3B细胞增殖能力的影响

使用H e p 3 B 细胞系和裸鼠构建了皮下成瘤模型。与对照组相比，H N K 治疗组的肿瘤体积[（0.8 6±0.3 2）vs.（0.41±0.14）cm3，P=0.012]和肿瘤重量[（0.85±0.24）vs.（0.43±0.16）g，P=0.007]均低于对照组（见图4）。

图1 HNK 对细胞活力的影响

图2 HNK 对Hep3B 细胞增殖能力的影响

图3 HNK 诱导Hep3B 细胞G1/S 期细胞周期阻滞

图4 HNK 对Hep3B 细胞体内成瘤能力的影响

表1 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的相对表达量，n=3）

表1 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的相对表达量，n=3）

注：与0 μM HNK 治疗组比较，*P ＜0．05；与20 μM HNK 治疗组比较，#P ＜0．05

2.4 HNK处理对细胞周期蛋白cyclin D1、P53、P27、P21的影响

如图5和表1所示：在HNK刺激24小时后，Hep3B中细胞周期蛋白cyclin D1表达水平下调，并呈现出剂量依赖性。同时， HNK处理后， Hep3B中细胞周期负性调节蛋白P53、P27、P21的表达水平上调。

图5 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的Western blot 结果

3 讨论

中草药活性成分用于预防和治疗癌症已有数百年历史，多种植物化学物质如生物碱、黄酮类、多酚化合物等均具有很大的抗癌潜力[9-10]。和厚朴酚（honokiol，HNK）是传统中草药厚朴的有效提取物之一，其抗肿瘤活性已在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤中得到验证[11-13]。

本研究表明，HNK能够在体外抑制HCC细胞Hep3B的增殖能力，这种抑制作用与诱导细胞周期G1/S阻滞有关，这与既往的相关研究结果一致[14]。为了进一步验证HNK对于HCC的治疗作用，我们构建了裸鼠皮下成瘤模型。体内实验结果与体外实验结果一致，结果均证实了HNK对HCC的增殖具有一定的抑制作用。

细胞周期调控涉及多种信号级联传导机制，包括DNA复制、细胞分裂和增殖等[15]。对G1期、S期、G2期等关键“检查点”的干扰将导致癌细胞的分裂失控和过度增殖[16]。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKIS）的失衡在其中起着关键作用[17]。细胞周期蛋白D1是细胞周期蛋白家族的一员，它可以与CDK4或CDK6形成复合物，用于调节细胞周期从G1向S期的转变[18]。已证实，在多种肿瘤的发生发展过程中均存在细胞周期蛋白D1的过度表达并伴随CDK活性的失调，由此引发的肿瘤细胞异常增殖[19]。由于HNK可以影响Hep3B细胞的细胞周期并抑制细胞周期从G1向S期的转变，我们推测HNK可能通过调节细胞周期蛋白的表达来抑制Hep3B细胞的增殖。本研究中，我们发现NHK治疗可以显著下调Hep3B细胞周期蛋白cyclin D1，上调CDK抑制蛋白p21和p27。同时，HNK治疗后肿瘤抑制蛋白p53的表达明显增加，而P53已被证实与细胞周期停滞有关[20]。总之，本研究证实了NHK可能是一种天然的细胞周期蛋白cyclin D1抑制剂，其通过诱导G1/S期阻滞来抑制肝细胞癌的发生。

综上，我们得出结论：NHK通过抑制细胞周期蛋白cyclin D1诱导细胞周期G1/S阻滞，进而抑制了Hep3B细胞在体内和体外的增殖。因此，HNK可能作为一种天然、安全、有效的肝细胞癌辅助治疗药物。