GC-MS方法分析新鲜枇杷叶挥发油及β-葡萄糖苷酶对枇杷叶的增香作用

宋宁,刘语,刘铮铮,杨广德

(西安交通大学药学院，西安 710061)

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.]的干燥叶，又名巴叶，是临床上常用的一味传统中药，具有清肺止咳，降逆止呕的功效[1]。《本草纲目》记载：“枇杷叶，治肺胃之病，大都取其下气之功耳。气下则火降痰顺，而逆者不逆，呕者不呕，渴者不渴，咳者不咳矣。”已有研究表明，枇杷叶中主要含有挥发油、三萜类、倍半萜类、多酚、黄酮类等化学成分，具有抗炎止咳、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等药理活性[2]。目前有关枇杷叶化学成分的研究主要集中在对其多糖、黄酮类、多酚类物质、三萜酸类等几类化合物的提取分离工艺及抗氧化等生物活性方面[3-6]，而对于其挥发油化合物分析鉴定方面鲜有研究报道。同时，枇杷叶作为肺胃之药，其挥发性成分可直接随空气吸入肺部，起效迅速，对治疗咳嗽、呕吐等疾病有重要作用，具有很高的药用价值。因此，本实验采用挥发油提取器法，提取新鲜枇杷叶中挥发油，并通过气相色谱-质谱联用方法进行成分分析，为进一步开发利用枇杷叶挥发油的药用价值提供科学依据。

β-葡萄糖苷酶是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶[7]，能水解水果、茶叶中的香气前体物——糖苷，释放出挥发性糖苷配基，用以增强果酒、果汁、茶叶等的香气[8-9]。本实验通过对比加入β-葡萄糖苷酶前后新鲜枇杷叶化学成分变化，以验证β-葡萄糖苷酶对其是否有增香作用。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：新鲜枇杷叶于2019年3月采自西安交通大学药学院的药园，由西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为蔷薇科植物枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.]的干燥叶。

仪器：GCMS-TQ8040型气相色谱-质谱联用仪(日本岛津)；AY120电子天平(日本岛津)。

试剂：β-葡萄糖苷酶(上海源叶生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱纯)；无水硫酸钠(西安化学试剂厂，分析纯)；磷酸氢二钠(河南焦作市化工三厂，分析纯)；柠檬酸(成都化学试剂厂，分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反应。分别称取两份100 g新鲜枇杷叶于250 mL pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，其中一份加0.5 g β-葡萄糖苷酶，另一份为空白对照。同时置于摇床中50 ℃恒温水浴5 h。

1.2.2 挥发油的提取。将β-葡萄糖苷酶水解前后的枇杷叶分别置于2000 mL圆底烧瓶中，加水800 mL，沸石数粒，摇匀，按2015版《中国药典(四部)》挥发油测定法(通则2204甲法)提取挥发油，保持微沸5 h。读取挥发油体积并收集所得挥发油，加入少量无水硫酸钠，静置。然后，称取挥发油置于10 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，待测。每个处理平行操作3次。

1.2.3 气相色谱-质谱条件

1.2.3.1 色谱条件。采用SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛细色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样量：1.0 μL；载气：He(≥99.99%)；进样口温度：250 ℃；流速：0.8 mL/min；分流比：5∶1；升温程序：色谱柱始温50 ℃，保持3 min，2 ℃/min升温至120 ℃，保持2 min，3 ℃/min升温至200 ℃，保持1 min，15 ℃/min升温至280 ℃，保持1 min。

1.2.3.2 质谱条件。接口温度：250 ℃；离子源：EI；离子源电压：60 ev；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围：45～550 m/z；溶剂峰切除时间：2.5 min，质谱检测起测时间：3.0 min。

1.2.4 数据处理。所得的色谱和质谱信息经数据处理系统与其内存谱库(NIST)自动检索和解析，并用峰面积归一法测定了各化学成分在挥发油中的相对百分含量。

2 结果

经GC-MS分析测得新鲜枇杷叶中挥发油提取物的总离子流图如图1所示。

图1 新鲜枇杷叶挥发油的GC-MS总离子流图

采用NIST标准质谱图数据库进行综合对比分析，由色谱峰面积归一化法计算各化学成分的质量分数，共鉴定出56种主要的挥发性化学成分，分析结果见表1。

表1 新鲜枇杷叶挥发油化学成分分析

续表1

保留时间/min化合物中文名分子式相对峰面积(%)鲜枇杷叶鲜枇杷叶∗8.613庚醛C7H14O0.160.1211.554苯甲醛C7H6O0.310.2613.2762,2,4,6,6-五甲基庚烷C12H260.700.5513.643(E,E)-2,4-庚二烯醛C7H10O0.290.1914.085正辛醛C8H16O0.150.1414.5241-乙基环己烯C8H140.530.2215.7152-乙基-1-己醇C8H18O0.2316.486苯乙醛C8H8O0.990.5817.5213,3-二甲基已烷C8H180.210.2718.548正辛醇C8H18O0.520.5820.489芳樟醇C10H18O1.181.5620.822壬醛C9H18O1.611.5026.010萘C10H80.460.3026.585丁酸顺式-3-己烯酯C10H18O20.440.4027.056α-松油醇C10H18O0.230.4327.261藏红花醛C10H14O0.2029.256γ-萜品醇C10H18O0.260.2231.138香叶醇C10H18O1.422.3431.900反式-2-癸烯醛C10H18O0.450.5935.0404'-羟基-2'-甲基苯乙酮C9H10O22.083.9137.922丁香酚C10H12O20.833.2141.860十四烷C14H300.200.3341.995β-大马酮C13H20O0.660.6544.720香叶基丙酮C13H22O0.140.1444.812反式角鲨烯C30H500.260.2845.130β-金合欢烯C15H240.300.5345.522角鲨烯C30H501.111.1548.1972,4-二叔丁基苯酚C14H22O2.311.0949.749正二十烷C20H420.130.1650.6474,7,9-巨豆三烯-3-酮C13H18O0.430.5451.090反式-橙花叔醇C15H26O45.8444.8351.477顺式-3-己烯醇苯甲酸酯C13H16O20.140.5852.1913,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛C15H22O20.380.6052.5712,2,4-三甲基戊二醇异丁酯C16H30O40.410.2954.685石竹素C15H24O0.140.1455.895正十七烷C17H360.300.1157.283十九烷醇C19H40O0.120.1957.532α-红没药醇C15H26O5.556.0257.923香叶醇基香叶醇C20H34O5.144.8358.995金合欢醇(法尼醇)C15H26O13.1511.9961.044苯甲酸苄酯C14H12O20.481.0861.417菲C14H100.350.2562.812正二十烷C20H420.360.4763.087正三十二烷C32H660.520.5364.380植酮C18H36O0.520.2964.920邻苯二甲酸二异丁酯C16H22O41.810.9465.080十五烷酸C15H30O20.1065.276柳酸苄酯C14H12O30.82

注：*代表加β-葡萄糖苷酶组

由表1可知，新鲜枇杷叶在分析鉴定出56种挥发性化学成分中，质量分数大于2.00%的挥发性化合物共有7种，分别为反式-橙花叔醇(45.84%)，金合欢醇(13.15%)，α-红没药醇(5.55%)，香叶醇基香叶醇(5.14%)，反式-3-己烯-1-醇(4.82%)，2,4-二叔丁基苯酚(2.31%)和4'-羟基-2'-甲基苯乙酮(2.08%)。 分析鉴定出的56种挥发性化学成分按化合物类型分类，分属于酯类(6种，占3.36%)，醇类(13种，占78.58%)，醛类(8种，占4.34%)，酮类(6种，占3.93%)，酚类(2种，占3.14%)，烷烃类(10种，占3.12%)，烯烃类(5种，占2.34%)和芳烃类(6种，占1.22%)8类化合物。其中，醇类化合物含量最高，质量分数为78.58%，相对含量最高的为反式-橙花叔醇(45.84%)，其次为金合欢醇(13.15%)，α-红没药醇(5.55%)，香叶醇基香叶醇(5.14%)，反式-3-己烯-1-醇(4.82%)。烯烃类和芳烃类化合物含量较低。这些化合物中酯类、醛类、酮类、醇类、酚类、烯烃类和烷烃类等化合物在新鲜枇杷叶挥发油中的质量分数差异，形成了挥发油特殊的气味。

通过表1的对比可知，在新鲜枇杷叶中β-葡萄糖苷酶存在作用。加入β-葡萄糖苷酶后增加了4种化合物，分别为2-乙基-1-己醇、藏红花醛、十五烷酸和柳酸苄酯，同时丁香酚、4'-羟基-2'-甲基苯乙酮、香叶醇的相对含量分别增加2.38%、1.83%和0.92%，增长率达到286.75%、87.98%和64.79%。此外，苯甲酸苄酯、α-红没药醇、顺式-3-己烯醇苯甲酸酯、芳樟醇、β-金合欢烯等化合物的相对含量也有所增加。同时可以看出，反式-3-己烯-1-醇、2,4-二叔丁基苯酚、金合欢醇(法尼醇)、反式-橙花叔醇、邻苯二甲酸二异丁酯等化合物的相对含量有所降低。

3 讨论

通过建立新鲜枇杷叶挥发油的气相色谱-质谱联用的分析方法，共鉴定出56个化合物的结构。从化合物结构类型来看，新鲜枇杷叶挥发油中主要是以反式-橙花叔醇(45.84%)、金合欢醇(13.15%)、α-红没药醇(5.55%)等为代表的醇类化学成分。有研究表明，金合欢醇、香叶醇规定为允许使用的食用香料[10]，α-红没药醇具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗寄生虫等作用，对多种肿瘤细胞也具有抑制作用[11]，金合欢醇和香叶醇基香叶醇具有抗肿瘤、杀菌等生理活性[12]，这为进一步开发和利用枇杷叶的药用、食品香料等方面价值提供理论依据。

从酶解前、后主要香气成分比较中可看出，酶解后许多香气成分的含量显著增加，酶解产生的键合态挥发性物质以醇类物质含量最高，如香叶醇、芳樟醇、反式-3-己烯-1-醇等。同时还有酚类物质(丁香酚)，酮类和萜烯类物质(β-金合欢烯)，这些物质都是植物中键合态香气物质的主要构成成分[13]，对整体香气有很大贡献。有研究表明，β-葡萄糖苷酶是参与醇系香气前驱体释放的重要酶类之一[14]。由此可见，导致酶解前后挥发性物质种类和数量上的差异是由于β-葡萄糖苷酶酶解新鲜枇杷叶中的“香味前驱体”释放出潜在的香气物质，因此，β-葡萄糖苷酶对其有增香作用。