mTORC1信号通路在毛囊生长期启动时特异促进毛囊干细胞增殖

张亦雅 谢红付 刘芳芬 徐伞 ，3 陈梦婷 ，3 李吉 ，2，3，4 邓智利 ，2，3，4

1中南大学湘雅医院皮肤科，长沙 410008；2器官损伤衰老与再生医学湖南省重点实验室，长沙 410008；3中南大学湘雅医院分子医学研究中心，长沙 410008；4中南大学湘雅医院国家老年疾病临床医学研究中心，长沙 410008

毛囊作为皮肤的重要附属结构，是人体内出生后仍具备周期性再生能力的少数微型器官之一［1］。在整个生命过程中，毛囊一直循环经历周期性的生长期、退行期和静止期，即毛囊生长周期［2-3］。位于毛囊上段、皮脂腺下端的外根鞘隆突部的毛囊干细胞（hair follicle stem cells，HFSC）在这一周期性的再生过程中扮演种子细胞的角色［1，4］。在毛囊从静止期向生长期转变时，毛囊干细胞接受来自周围环境（主要是真皮乳头）的信号后被激活，从而启动毛囊生长期，并增殖分化形成毛囊外根鞘（包括毛囊前体细胞），进一步向下迁移形成毛基质细胞，并最终形成新的内根鞘和毛干［5-6］。

调控毛囊周期性再生过程的信号通路主要分为两类即激活性和抑制性信号。其中Wnt/β 联蛋白信号能够促进毛囊干细胞活化和生长期启动。与Wnt 信号相反，骨形成蛋白信号对毛囊干细胞维持相对静止状态具有关键作用，在毛囊干细胞活化过程中起抑制作用［7-8］。我们研究发现，哺乳动物西罗莫司靶蛋白复合物1（mTORC1）信号通路在毛囊生长周期中发生周期性激活，并在毛囊生长期启动即毛囊干细胞活化过程中发挥关键作用，从而调控毛发再生过程［9］。但是关于mTORC1 信号通路在毛囊生长期启动过程中发挥作用的窗口期仍不清楚，且其是否还调控其他毛囊细胞的增殖也未见研究。本研究拟通过利用mTORC1 的特异抑制剂西罗莫司［9］在毛囊生长期启动的不同阶段抑制小鼠皮肤mTORC1信号，探索该信号通路发挥作用的窗口期，及其对其他毛囊细胞增殖的影响，为进一步研究mTOR 信号通路在毛发再生中的功能与应用奠定基础。

材料与方法

一、实验动物

用于繁殖的 15 只（10 雌 5 雄）SPF 级 8 周龄（体重约20 g）ICR 小鼠（实验动物合格证号：110059764）来自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于本校医学遗传学重点实验室实验动物中心无特定病原体（specific pathogen free，SPF 级）环境中，动物实验许可证号：SYXK（湘）2015-0014。小鼠健康状况良好，自由饮水取食，人工控制光照（12 h 光照，12 h 黑暗）。将小鼠按照1 雄2 雌合笼繁殖，获得新生小鼠用于后续实验。研究方法与过程均符合中南大学湘雅医院动物伦理委员会相关规定及要求。

二、主要试剂及实验仪器

兔抗小鼠pS6（Ser235/236，细胞mTORC1 信号激活的下游标志分子）抗体、CD34（毛囊干细胞标志分子）抗体、Ki67（细胞增殖标志分子）抗体（美国CST公司），大鼠抗小鼠钙黏蛋白（Pcad）抗体（美国R&D 公司），正常羊血清/驴血清（美国Jackson ImmunoResearch公司），Alexa Fluor 594标记的驴抗兔IgG 荧光二抗（美国ThermoFisher 公司），Alexa Fluor 488 标记的驴抗大鼠IgG 荧光二抗（英国Abcam 公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（美国Sigma公司）。

三、实验方法

1.ICR小鼠分组及处理：36只新生小鼠随机分为对照组、RAPA-P19组、RAPA-P21组，每组12只。剃毛后，RAPA-P19组于出生后第19 ～24天、RAPAP21 组于出生后第21 ～ 24 天每天下午4 点腹腔注射西罗莫司，剂量为 5 mg·kg-1·d-1［10］，对照组在第19 ～24天腹腔注射同等体积的溶剂。

2.取材：各组小鼠分别于第 22、23、24 天断颈处死（各4 只），剃除背毛，用眼科剪和镊子取背部剃毛区域皮肤用于后续实验。

3.苏木精-伊红（HE）染色：将部分新鲜小鼠皮肤组织用4%多聚甲醛固定后，按常规制做切片并行HE染色。显微镜下观察。

4.免疫荧光染色：部分新鲜小鼠皮肤-80 ℃速冻，制作冰冻切片。将8 μm 厚的冰冻切片在室温下晾干10 min，用4%多聚甲醛在室温下固定10 min，PBS冲洗3次，每次5 min。然后用5%正常羊血清/驴血清封闭液（含0.3%Triton X-100 和1%牛血清白蛋白）于室温下孵育切片1 h，封闭非特异性抗原。弃封闭液，在切片上加一抗溶液，4 ℃孵育过夜；阴性对照以封闭液代替一抗。次日，用PBS洗涤切片3次，每次15 min，然后加入用封闭液稀释（1∶150）的相应荧光标记的二抗，室温避光孵育1 h，PBS 清洗。用1 mg/L 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚在室温孵育切片5 min，复染细胞核，PBS 洗2次，每次5 min。盖玻片覆盖封片后储存于-20 ℃，1 周之内用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并采集图片。

5.图片处理和统计学分析：HE 染色和免疫荧光染色采集的图片用Photoshop CS5和Image J软件处理。采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，多重检验采用Tukey法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同阶段抑制mTORC1信号对毛囊周期的影响

HE 染色显示，在出生后第24 天时，对照组小鼠毛囊毛球膨大且延伸入脂肪层，毛干明显变粗，呈现明显生长期形态；RAPA-P19 组小鼠毛囊毛乳头仍紧邻隆突部，且未伸入脂肪层，为明显静止期形态；但是，RAPA-P21 组小鼠毛囊和对照组一样，毛球明显膨大，毛干增粗且延伸入脂肪层，呈现生长期形态，见图1。统计结果显示，对照组和RAPAP21组毛囊进入生长期的比例分别为95%±3.74%和 94% ± 2.16%，而 RAPA-P19 组仅为 2.25% ±2.21%，3 组间差异有统计学意义（F = 144，P ＜0.001），且 RAPA-P19 组与对照组和 RAPA-P21 组比较，差异均有统计学意义（t 值分别为-42.65 和-59.28，均P ＜ 0.01），而对照组与RAPA-P21 组间差异无统计学意义（t=0.46，P=0.871）。

二、不同阶段抑制mTORC1信号对毛囊干细胞及其他细胞增殖的影响

免疫荧光共染色结果表明，在第22 和23 天时对照组毛囊干细胞pS6 明显阳性，RAPA-P19 组和RAPA-P21组毛囊中均未见pS6阳性的毛囊干细胞（图2A）。而且，对照组毛囊干细胞Ki67 明显阳性，RAPA-P19 组毛囊中未见Ki67 阳性毛囊干细胞，但是RAPA-P21 组毛囊中大部分毛囊干细胞Ki67也为阳性（图2B）。

在第23 天时，与对照组一样，RAPA-P19 组和RAPA-P21组毛囊中除毛囊干细胞以外的其他细胞如皮脂腺细胞、毛囊隆突部上端的表皮细胞等Ki67均阳性，见图3。

讨 论

mTOR是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为整合营养利用、能量状态、细胞应激源以及生长因子的信号通路调节中枢，它参与调节生物体的生长和稳态，以及细胞增殖与存活等生理过程［11-12］。mTOR 可与其他蛋白组合形成两种不同的蛋白复合物，即对西罗莫司敏感的复合物mTORC1和对西罗莫司不敏感的复合物mTORC2，且它们在真核生物中都功能保守［10］。我们先前研究发现，在毛囊生长周期中，mTORC1信号通路在毛囊干细胞中呈周期性的活化，并在毛囊生长期启动中发挥关键作用［9］。本研究中，我们进一步通过西罗莫司抑制毛囊中的mTORC1 信号，并结合HE 染色和免疫荧光共染色技术，发现mTORC1信号通路在毛囊从静止期向生长期转变过程中特异性促进毛囊干细胞的增殖。

毛囊从静止期向生长期转变，即毛囊干细胞活化阶段是毛囊进入生长期的关键时期。在此过程中，毛囊干细胞的增殖尤为重要［4，13］。本研究显示，在生长期启动前抑制mTORC1 信号能有效阻断毛囊干细胞的增殖，但是在生长期启动后，即毛囊干细胞活化后，抑制mTORC1并不能明显抑制毛囊干细胞的增殖，说明在毛囊进入生长期的过程中，mTORC1 信号通路存在一个发挥作用的关键窗口期，而这个窗口期即为毛囊干细胞活化的时期。我们前期研究提示，在这个窗口期内，mTORC1 可能通过克服高水平的骨形成蛋白信号来促进毛囊干细胞的增殖［9］。但是关于在这个窗口期诱发mTORC1 信号通路活化的上游信号仍需进一步研究。

图1 HE染色检测不同阶段抑制mTORC1信号对毛囊生长周期的影响 在第24天时，对照组和西罗莫司第21天处理组（RAPA-P21组）毛囊呈生长期形态，而第19天处理组（RAPA-P19组）毛囊仍呈静止期形态。各图放大倍数相同，标尺为50 μm

图2 免疫荧光共染色检测不同阶段抑制mTORC1信号对毛囊干细胞增殖的影响 2A：在第22（P22）和23天（P23）时，对照组毛囊干细胞pS6阳性，而西罗莫司第19天处理组（RAPA-P19组）和RAPA-P21组毛囊干细胞均pS6阴性。2B：在第22和23天时，对照组和RAPA-P21组中毛囊干细胞Ki67阳性，而RAPA-P19组毛囊干细胞未见Ki67阳性信号

图3 第23天时免疫荧光共染色检测抑制mTORC1信号对毛囊中非干细胞增殖的影响 对照组、西罗莫司第19天处理组（RAPA-P19组）和21天处理组（RAPA-P21）3组毛囊中皮脂腺和其他毛囊细胞均可见明显Ki67核定位

既往研究显示，mTOR 信号通路可促进成体干细胞增殖，例如造血干细胞［12，14-15］。与既往研究一致，本研究显示，抑制mTORC1 信号能够抑制毛囊干细胞的增殖，却不会影响毛囊中其他细胞的增殖，说明mTORC1信号促进毛囊干细胞的增殖具有时空特异性。在毛发再生过程中，毛囊干细胞的增殖与分化起着关键性作用［6］，mTORC1 信号在这一过程中可特异性促进毛囊干细胞的增殖，该结果也进一步凸显mTORC1 信号通路在促进毛发再生中的重要性。

综上所述，在毛囊从静止期向生长期转变过程中，mTORC1信号通路可特异性促进毛囊干细胞的增殖，这为临床治疗脱发提供了一个潜在的靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突