热休克蛋白5调控内质网应激在视网膜色素上皮细胞保护中的作用△

冯竞仰 陆冰 朱鸿 孙向军 孙晓东

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)位于脉络膜与视网膜神经上皮层之间，参与组成血-视网膜屏障，吞噬转运视循环产物，对维持光感受器细胞代谢和视网膜功能起着至关重要的作用。生理状态下，RPE细胞不断吞噬光感受器细胞外节脱落的膜盘以维持其日常代谢。随着年龄增长，部分不能被溶酶体消化的膜盘沉积在RPE细胞内，形成脂褐素[1]。大量脂褐素堆积并释放光化学毒性物质导致RPE细胞损伤和功能减退，是年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)发病的重要机制之一[2-3]。N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine，A2E)作为RPE细胞内脂褐素的主要荧光基团，可在430～480 nm波段内的光照刺激下产生大量活性氧，导致RPE细胞损伤[4]。近年来，随着对细胞损伤机制研究的不断深入，人们发现除了经典的线粒体相关凋亡途径外，内质网同样可以感知和整合损伤信号，参与细胞凋亡[5]。本研究通过建立A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤模型，探讨内质网应激参与RPE细胞损伤的过程，以及相对分子质量70 000的热休克蛋白5(heat shock 70 kDa protein 5，HSPA5)对RPE细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器人ARPE-19细胞株(American Type Culture Collection，美国)，全反式视黄醛、乙醇胺(Sigma，美国)，DMEM/F12(Dulbecco’s modified Eagle’s/Ham’s F12)11培养液、胎牛血清(Gibco，美国)，CCK-8细胞活性检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天，中国)，慢病毒质粒LV-HSPA5-GFP-shRNA、LV-NC-GFP-shRNA(上海吉玛制药技术有限公司)，HSPA5单克隆抗体(Cat.3216-1，Epitomics，美国)，CHOP单克隆抗体(Cat.sc-7351)、caspase-12多克隆抗体(Cat.sc-70227)、β-actin单克隆抗体(Cat.sc-8432；Santa Cruz，美国)。L18W/71型蓝光灯(Osram，德国)，5202型数字光照度计(Kyoritsu，日本)，IX70型倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜(Olympus，日本)，680型酶联免疫检测仪(Bio-Rad，美国)等。

1.2 方法

1.2.1 RPE细胞培养人RPE细胞复苏后加入DMEM/F12培养液(含体积分数10%胎牛血清)，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱培养。根据细胞生长速度，按12比例传代继续培养。使用胰蛋白酶溶液收集对数生长期RPE细胞，计数后稀释至100× 106个·L-1。将细胞悬液依据实验要求接种于培养皿，待RPE细胞贴壁生长至80%～90%融合后，换成无血清培养液，放置24 h后再接受处理。

1.2.2 A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤模型建立A2E由全反式视黄醛和乙醇胺依据参考文献化学合成[4，6]。(1)A2E与RPE细胞共培养：将含25 μmol·L-1A2E的培养液加入RPE细胞中，置于培养箱中孵育2 h；去除原培养液，温PBS清洗细胞，充分洗去细胞外A2E，重新加入不含胎牛血清培养液，继续培养24 h；运用光学倒置显微镜观察RPE细胞内A2E颗粒情况；激光共聚焦显微镜观察RPE细胞内A2E自发荧光情况。(2)联合蓝光诱导RPE细胞损伤：采用L18W/71型蓝光灯在(460±20)nm照射A2E共培养后的RPE细胞20 min，光照在暗室中密闭进行，无自然光干扰，电子温度计监测室温为(37.0±0.3)℃，光照度计检测细胞水平上光照强度为4000 lux。对照组为不作任何处理的RPE细胞。

1.2.3 HSPA5 shRNA慢病毒载体构建和转染干扰质粒LV-HSPA5-GFP-shRNA(干扰序列5’-GCTCGACTCGAATTCCAAAGA-3’)和阴性对照LV-NC-GFP-shRNA(干扰序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)的构建由上海吉玛制药技术有限公司完成。将RPE细胞按每孔1.5 × 106个接种至24孔培养板内，培养24 h，每孔加入0.5 mL凝胶胺，使其浓度为6 mg·L-1，室温孵育30 min以提高细胞感染效率，再加入含shRNA慢病毒颗粒的培养液，每孔200 μL，培养过夜后更换为新鲜培养液，继续培养48 h。采用750 μg·L-1嘌呤霉素进行药物筛选，将筛选出的耐药细胞株扩大培养，获得稳定沉默HSPA5基因的RPE细胞。细胞随机分为3组：转染HSPA5干扰序列的RPE细胞为HSPA5干扰组；转染阴性对照序列的RPE细胞为阴性干扰组；未转染的RPE细胞为野生型组。转染72 h后做后续实验。采用荧光显微镜观察RPE细胞内GFP荧光表达，Western blot检测HSPA5蛋白表达，验证HSPA5基因干扰有效性。

1.2.4 RPE细胞活力检测采用CCK-8法检测细胞活力。收集对数生长期RPE细胞，计数后稀释至100×106个·L-1，以每孔100 μL接种于96孔培养板内。按各实验目的处理细胞：(1)按1.2.2方法诱导A2E联合蓝光损伤RPE细胞后，分别培养3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，检测细胞活力的变化；(2)按 1.2.3 方法处理细胞后，对HSPA5干扰组、阴性干扰组、野生型组RPE细胞均给予A2E联合蓝光诱导细胞损伤后继续培养12 h，检测细胞活力的变化；(3)检测对照组细胞活力。具体检测方法为：去除培养液，温PBS冲洗细胞，每孔加入含20 μL CCK-8试剂的培养液100 μL，置于培养箱内继续孵育2 h。采用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定吸光度值。最终细胞活力结果表示为A2E处理组吸光度值与对照组吸光度值的比值。每组设定5个复孔，实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测RPE细胞培养于9 cm培养皿中，按各实验目的处理细胞：(1)按1.2.2方法诱导A2E联合蓝光损伤RPE细胞后，分别培养3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，检测HSPA5和CHOP蛋白的表达变化；(2)按1.2.3方法处理细胞后，检测HSPA5干扰组、阴性干扰组、野生型组HSPA5蛋白表达情况，之后对3组细胞均给予A2E联合蓝光诱导细胞损伤后继续培养12 h，检测HSPA5、CHOP和Caspase-12蛋白的表达变化；(3)检测对照组HSPA5、CHOP和Caspase-12蛋白的表达。具体检测方法为：去除培养液，PBS冲洗，加入细胞裂解液。收集细胞，于4 ℃ 下12 000 r·min-1离心5 min，取含蛋白的上清液。每100 μL蛋白样品加入25 μL 蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴8 min。运用SDS-PAGE对样品中的蛋白进行分离，并转移至PVDF膜。使用含50 g·L-1脱脂牛奶和体积分数0.1%Tween-20的TBS封闭 2 h，分别加入11000稀释的HSPA5抗体、1200稀释的CHOP抗体、1200稀释的Caspase-12抗体，于4 ℃孵育过夜。TBST冲洗后加入二抗，于37 ℃孵育2 h。使用ECL显色，Bio-Rad凝胶成像仪采集图像。运用Image-J分析条带灰度值。

1.3 统计学分析使用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，采用单因素方差分析比较组间差异性，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤倒置相差显微镜下观察发现，A2E共培养的RPE细胞内出现棕黄色颗粒，而对照组RPE细胞中未见明显颗粒状物质。激光共聚焦显微镜观察发现，A2E共培养的RPE细胞中A2E呈现绿色自发荧光，而对照组未观察到该荧光。CCK-8法检测结果显示，A2E联合蓝光处理后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，RPE细胞活力分别是对照组的(80.9±6.2)%、(73.3±5.8)%、(70.6±5.4)%、(62.3±6.1)%和(51.4±4.5)%，与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图1。

2.2 RPE细胞损伤时内质网应激相关蛋白HSPA5和CHOP表达Western blot检测结果显示，内质网应激标志分子HSPA5蛋白表达在RPE细胞损伤后6 h显著升高，12 h时达到高峰，之后逐渐下降。而CHOP作为内质网应激介导的凋亡相关分子，在对照组表达量低，经A2E及蓝光处理后3 h CHOP蛋白表达出现升高，12 h时有小幅回落，24-48 h时又逐步上升(图2)。提示内质网应激参与A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤。

图1 A2E与RPE细胞共培养。A：倒置相差显微镜下，A2E共培养的RPE细胞内出现棕黄色颗粒；B：倒置相差显微镜下，对照组中未见明显颗粒状物质；C：激光共聚焦显微镜下，A2E共培养的RPE细胞中A2E呈绿色自发荧光；D：激光共聚焦显微镜下，对照组中未观察到该荧光

图2 Western blot检测A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤后HSPA5和CHOP蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05

2.3 HSPA5基因干扰RPE细胞稳株获得为了验证HSPA5基因干扰的RPE细胞是否稳定且有效，通过荧光显微镜观察发现，慢病毒处理RPE细胞后72 h，HSPA5干扰组细胞内存在GFP荧光表达，提示RPE细胞已被LV-HSPA5-GFP-shRNA有效转染。采用Western blot检测转染RPE细胞中HSPA5蛋白表达，结果显示，慢病毒处理72 h后，HSPA5干扰组中HSPA5蛋白表达较野生型组显著下降(P<0.05)，而阴性干扰组HSPA5蛋白表达与野生型组相比未受明显抑制(P>0.05)。见图3。

2.4 沉默HSPA5加重A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤Western blot检测结果显示，A2E联合蓝光损伤RPE细胞后12 h，HSPA5干扰组中HSPA5蛋白表达较野生型组和阴性干扰组均明显下降(均为P<0.05)。HSPA5干扰组与野生型组、阴性干扰组相比CHOP和Caspase-12蛋白表达均显著提高(均为P<0.05)。细胞活力检测结果显示，A2E联合蓝光处理RPE细胞后12 h，HSPA5干扰组RPE细胞活力降低至(56.3±5.1)%，较野生型组(72.9±7.1)%和阴性干扰组(70.3±6.6)%均显著降低(均为P<0.05)。提示HSPA5基因干扰可上调内质网应激相关凋亡蛋白CHOP、Caspase-12的表达，并加重A2E及蓝光对RPE细胞的损伤。见图4。

图3 HSPA5基因干扰RPE细胞稳株获得。A：光镜下LV-HSPA5-GFP-shRNA转染RPE细胞后72 h，HSPA5干扰组细胞(标尺：50 μm);B:荧光显微镜下LV-HSPA5-GFP-shRNA转染RPE细胞后72 h，HSPA5干扰组细胞内存在GFP荧光表达(标尺：50 μm)；C：Western blot检测电泳结果；D：Western blot检测数据分析结果，慢病毒处理72 h后，HSPA5干扰组中HSPA5蛋白表达较野生型组显著下降(*P<0.05)，而阴性干扰组HSPA5蛋白表达未受明显抑制

图4 沉默HSPA5加重A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤。A：Western blot检测电泳结果；B：Western blot检测数据分析结果，A2E联合蓝光损伤RPE细胞后12 h，HSPA5干扰组中的HSPA5蛋白表达较野生型组和阴性干扰组均明显下降(*P<0.05)，CHOP和Caspase-12蛋白在HSPA5干扰组中的表达与野生型组和阴性干扰组相比均显著提高(*P<0.05)；C：细胞活力检测结果显示，A2E联合蓝光损伤RPE细胞后12 h，HSPA5干扰组RPE细胞活力较野生型组和阴性干扰组均显著降低(*P<0.05)

3 讨论

RPE细胞对维持光感受器细胞代谢和视网膜功能起着至关重要的作用。随着年龄增长，脂褐素积聚于RPE细胞内，持续暴露于可见光、紫外线等，诱发光化学毒性物质释放，导致RPE细胞损伤是AMD病理改变的始动环节。正常RPE细胞可通过自噬及溶酶体相关途径逐步降解被吞噬的膜盘，以保持RPE细胞内环境稳定。然而，随着RPE细胞的衰老，其处理代谢产物的能力下降，大量有害物质无法被清除，形成脂褐素积聚。有研究证实，老年人视网膜黄斑部RPE细胞内脂褐素可占到整个细胞面积的约20%[7]。Eldred[8]从老年人视网膜组织中提取出大量脂褐素颗粒，并从中分离出其主要荧光基团A2E。A2E具有很强的光化学毒性，尤其对蓝光敏感。本研究观察到RPE细胞吞噬了A2E后，在蓝光照射下细胞活力出现显著下降，且随着时间延长细胞损伤加重。有研究表明，在蓝光激发下，A2E会发生光氧化反应产生多种活性氧，包括单态氧、过氧化物等[9]。一方面这些活性氧可以攻击细胞的线粒体、内质网、DNA双链等，直接导致RPE细胞损伤[10]，另一方面又可以诱导A2E之间通过C-C双键结合，形成A2E的环氧化合物。这些环氧化合物既能进一步加速活性氧生成，又能导致RPE细胞损伤[11]。

新近研究发现，内质网可以感知和整合损伤信号，参与细胞凋亡，在AMD发病机制中起重要作用[12]。作为真核细胞中新合成蛋白质折叠与组装的加工厂，内质网对外界应激因素十分敏感。在各种应激原刺激下，大量错误折叠或未折叠蛋白会在内质网内聚集，引起内质网稳态失衡诱发内质网应激[13]。本研究结果显示，A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤时内质网应激相关分子HSPA5和CHOP蛋白表达较正常对照组显著升高。HSPA5又称免疫球蛋白重链结合蛋白，是热休克蛋白70家族成员之一，长期位于内质网内，是内质网应激感受器和关键分子伴侣[14]。生理状态下，HSPA5通常与内质网膜上的三种跨膜蛋白，即类RNA依赖蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、转录激活因子6(ATF6)、肌醇依赖内质网至细胞核信号激酶1(IRE1)结合，处于休眠状态。内质网应激发生初期，HSPA5与跨膜蛋白解离，启动未折叠蛋白反应，同时自身表达上调，辅助蛋白质正确折叠，清除异常蛋白，以恢复内质网稳态，维持细胞生存[15]。本研究中HSPA5蛋白在RPE细胞损伤早期升高，提示在A2E及蓝光照射刺激下，RPE细胞出现一系列内稳态失衡，激活了内质网应激反应，早期通过上调HSPA5蛋白表达，协助异常蛋白折叠并启动降解途径，从而促进内质网恢复稳态。而RPE细胞损伤后48 h，HSPA5蛋白水平呈下降趋势，推测持续剧烈的应激导致RPE细胞不可逆损伤，从而激活内质网应激介导的凋亡途径。

CHOP作为内质网应激介导的凋亡途径中重要调控分子之一，在正常生理条件下表达量较低，当受到应激刺激时，CHOP表达水平升高，提示细胞启动内质网应激相关凋亡途径[16]。有趣的是本研究发现，RPE细胞损伤后CHOP蛋白表达趋势并不是持续增高，而是呈现2个高峰，分别在损伤后6 h和48 h。我们推测第一个高峰可能是由于A2E及蓝光急性损伤RPE细胞所致，而后RPE细胞启动一系列防御机制，包括上调HSPA5激活内质网应激相关降解途径等，在一定程度上清除有害物质，修复细胞功能，维持RPE细胞稳态。然而随着时间延长，损伤超过RPE细胞代偿能力，最终走向内质网应激介导的凋亡途径。

本研究结果还表明，当基因干扰HSPA5表达时，内质网应激介导的凋亡相关分子CHOP和Caspase-12蛋白表达增高，并且加重了A2E及蓝光对RPE细胞的损伤。这一结果表明内质网应激发生时，HSPA5具有部分抵抗凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的作用，减轻A2E及蓝光对RPE细胞的损伤。有研究认为，HSPA5激活是细胞在面对应激时一种重要的防御机制，该机制对细胞有保护作用[17]。在肿瘤研究中发现，癌细胞的HSPA5水平普遍较正常细胞高，它可能参与降低细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，抵抗癌细胞凋亡[18]。在年龄相关性神经退行性疾病研究中也发现，抑制HSPA5可以增加神经元对β淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡的敏感性，而提高HSPA5表达则可以保护海马部位神经元，减轻β淀粉样蛋白沉积对其造成的损伤[19-20]。

综上所述，内质网应激参与A2E联合蓝光诱导的RPE细胞损伤。HSPA5具有调控内质网应激反应，减轻A2E及蓝光诱导的细胞损伤，促进RPE细胞存活的作用。本研究初步揭示了AMD中RPE细胞损伤机制，为今后早期干预，增强细胞内源性保护和代偿机制提供了理论依据，也为AMD潜在治疗靶点研究提供了新思路。