斯氏属线虫生物学特性对冷驯化寄主昆虫的响应

LewisEEdwin王从丽

(1．中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081； 2．美国爱达荷大学 植物、土壤和昆虫学系，爱达荷 美国 ID 83844)

0 引 言

温度是制约昆虫种群发生、分布和扩散的重要环境因子。在长期进化和自然选择过程中，昆虫形成了一系列适应外界温度变化的策略。其中，冷驯化作为一种有效提高耐寒能力的途径，在昆虫对环境温度昼夜和季节变化的适应中发挥着重要作用。自然界中的很多种昆虫经常暴露在不利的低温环境中，使得存活成为多种昆虫的主要挑战[1]，而暴露于非致命低温环境可以提高昆虫的抗低温能力等特性[2-3]。张刚应和杨怀文[4]研究发现，斯氏线虫Steinernemacarpocapsae对12 ℃贮存一周的大蜡螟(Galleriamellonella)幼虫的致死率没有明显变化，但大蜡螟幼虫的12 ℃贮存时间对线虫侵染强度有明显的影响。杨秀芬等[5]证实了低温诱导有助于培育斯氏线虫A54适应0 ℃以上的低温特性，但恢复25 ℃培养2个侵染循环后线虫耐低温特性有不同程度的丧失。5 ℃储存349 d的S.carpocapsae对大蜡螟幼虫的侵染力较新培养的线虫显著下降[6]。但对关于低温驯化的寄主昆虫对昆虫病原线虫其它方面的生物学特性的影响还未见报道。

环境温度也是限制昆虫病原线虫推广应用的因素之一。我国东北地区，春秋季昼夜温差大，不耐低温的病原线虫存活率降低，致病力下降。例如，我国北方的韭菜根蛆每年4、5月份是为害盛期，此时地温较低，非耐低温的线虫不易侵染，所以低温下防治效果很差[7-8]。而从我国寒冷地区—黑龙江省分离到的耐寒昆虫病原线虫对北方韭菜根蛆的防治效果达100%[9-10]。因不同线虫种(品系)对温度的适应性与其最初的自然生长环境有关[11-12]，使得昆虫病原线虫的生物学特性不同，对害虫防治效果也存在很大差异[13]。

该研究采用非耐寒和相对较耐低温的昆虫病原线虫为研究对象，试图探索其侵染力、繁殖力及存活力对低温驯化后的寄主昆虫的响应，以明确低温驯化后的寄主昆虫对昆虫病原线虫生物学特性的影响，为昆虫病原线虫在昼夜或季节温差较大地理区域的害虫防治应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试寄主昆虫：开心果、胡桃、巴旦木和核桃里的害虫—脐橙螟Amyeloistransitella(Walker)，由美国圣华金河谷农业科学中心的Siegal研究员提供的卵和食物。其饲养方法参照Siegal等[14]，将卵置于25 ℃、光照12 h、相对湿度70%的培养箱中，从卵饲养到五龄幼虫约25 d。

供试昆虫病原线虫：S.carpocapsae和S.feltiae，由美国加州大学戴维斯分校提供，采用White trap[15]方法，以大蜡螟为寄主昆虫进行繁殖，30 d内备用。

1.2 试验方法

将脐橙螟5龄幼虫进行10 ℃、15 ℃、20 ℃和25 ℃4个温度处理。每处理3个培养皿(直径60 mm)，皿内垫有同皿底一样大小的双层滤纸，再向皿内加0.5 mL蒸馏水。每皿10头5龄幼虫，每头幼虫体重约0.05 g，置于不同温度的恒温培养箱中，每天向皿内加0.1 mL水保湿。7 d后取出所有温度处理的培养皿置于室温1 d。

不同温度处理后的脐橙螟幼虫，用线虫S.carpocapsae和S.feltiae侵染，侵染剂量为50条侵染期线虫(IJs)/头幼虫，于25 ℃培养。接种线虫后24 h和48 h，调查脐橙螟幼虫死亡率，并解剖幼虫调查侵入体内的线虫数量，计算实际侵入率，每皿解剖1头。然后，保证每皿5头幼虫，25 ℃培养8 d，调查幼虫体表是否有线虫出现，并计算脐橙螟幼虫体表有线虫出现的比率。培养至22 d～26 d，收集所有线虫，计算产量。

经不同温度驯化寄主体内繁殖后的线虫加入50目无菌沙子中，保持沙子含水量为5%，直径为40 mm的塑料培养皿中装有沙子5 g，含有500条收集到的侵染期线虫。每处理3皿，将培养皿直接投入-15 ℃冰箱中20 min后，取出后置于室温12 h，将沙子倒入250 ml烧杯，加水漩涡，倒出上清液，显微镜下调查上清液中线虫的冷冻存活率。

1.3 数据分析

每个试验重复3次。试验中调查所得数据经Excel处理和SPSS11.5软件分析，采用单因素(One-Way ANOVA)于0.05水平方差分析各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 低温驯化寄主对昆虫病原线虫致病力的影响

从线虫对5龄脐橙螟幼虫经4个温度处理后的致死率可以看出(图1)，侵染24 h时，线虫对4个温度处理后的寄主昆虫致死率无显著影响，S.carpocapsae对寄主的致死率为52.6%～70.0%，S.feltiae的致死率为40.7%～61.9%。48 h时，S.carpocapsae对寄主的致死率均达100%，S.feltiae的致死率为81.4%～96.7%，并且S.feltiae对经10 ℃处理的5龄脐橙螟幼虫致死率(96.7%)显著高于25 ℃处理(81.4%)(P<0.05)。分析其原因可能是寄主昆虫经过10 ℃处理7d后昆虫本身免疫力降低，使得中间型的S.feltiae线虫致病力明显增强，但对于伏击型的S.carpocapsae对寄主的致死率没有明显影响，因为寄主的校正死亡率均已达100%。

2.2 低温驯化寄主对线虫侵入力的影响

不同温度处理5龄脐橙螟幼虫对两种线虫的侵入率影响较大(图2)，随着寄主温度的降低，2种线虫的侵入率呈升高趋势。25 ℃、20 ℃和15 ℃处理幼虫7d后，S.carpocapsae对寄主的侵入率分别为26.0%，36.3%和36.0%，差异不显著，但均显著低于10 ℃处理(49.3%)(P<0.05)。20 ℃和25 ℃处理7 d后S.feltiae对寄主的侵入率为20%和24%，均显著低于10 ℃(39.7%)和15 ℃处理(32.3%)(P<0.05)。表明随着寄主昆虫驯化温度的降低，其对昆虫病原线虫侵入的抵抗力降低，导致线虫更容易侵入体内，侵入体内线虫的数量增加。

图1昆虫病原线虫对低温驯化寄主的致病力
Fig.1ThevirulenceofEPNstonavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

注：柱状图上方的相同字母表示同一种线虫对10、15、20、25℃驯化寄主之间的致死率差异不显著。

Note:The same letters on the top of bar chart indicate similar mortality ofS.carpocapsaeorS.feltiaeto acclimated hosts at 10、15、20、25 ℃ for 7 d.

图2昆虫病原线虫对低温驯化寄主的侵入力
Fig.2ThepenetrationofEPNstonavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

2.3 低温驯化寄主对线虫繁殖速度的影响

线虫侵染后8d调查结果显示(图3)，不同温度处理5龄脐橙螟幼虫对线虫侵染后从寄主体表出现的寄主比例影响很大，该比例为体表有线虫出现的寄主数量占总寄主数量的比例。随着处理温度的降低，2种线虫从体表出现的寄主比率呈升高的趋势，尤其线虫S.feltiae的升高趋势更明显。25 ℃、20 ℃和15 ℃处理7 d后有S.feltiae出现的寄主比率分别为43.3%、53.3%和66.7%，均显著低于10 ℃处理(93.3%)(P<0.05)，即随着寄主昆虫驯化温度的降低，线虫侵入后在寄主昆虫体内繁殖的速度加快，寄主体表有线虫出现的比例增多。因为同一种线虫在寄主体内繁殖的代数是相同的，只有线虫在寄主体内繁殖速度快把寄主体内物质消耗完才能从寄主体内钻出到体表，所以体表有线虫出现的寄主比例越大意味着其体内线虫繁殖速度越快。

2.4 低温驯化寄主对线虫产量的影响

低温驯化5龄脐橙螟幼虫对线虫S.carpocapsae和S.feltiae产量影响较大(图4)。S.carpocapsae在15 ℃和10 ℃驯化7 d幼虫体内的产量为9 462和11 309条侵染期线虫(IJs)/头幼虫，显著高于25 ℃和20 ℃处理的产量(6 318和6 411 IJs /头幼虫)(P<0.05)，10 ℃驯化寄主后的产量较25 ℃高出79%。S.feltiae线虫在10 ℃驯化7 d脐橙螟幼虫体内繁殖的产量是2 286 IJs/头幼虫，显著高于其它3个处理温度，15 ℃、20 ℃和25 ℃处理的产量分别为1 804、1 353和987 IJs/头幼虫，处理之间差异显著(P<0.05)，其中，10 ℃较25 ℃的线虫产量高出131.7%。表明低温驯化寄主昆虫有助于提高昆虫病原线虫的繁殖产量。

图3低温驯化寄主对昆虫病原线虫从寄主体表出现的影响
Fig.3TheemergenceofEPNsinfectingnavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

图4低温驯化寄主对昆虫病原线虫产量的影响
Fig.4TheyieldofEPNsinfectingnavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

2.5 经低温驯化寄主体内繁殖出线虫的冷冻存活能力

从不同温度驯化的寄主脐橙螟5龄幼虫体内繁殖出的线虫直接投入-15 ℃冰箱中20 min后的冷冻存活率来看，随着寄主幼虫驯化温度的降低，2种线虫的冷冻存活率均有上升趋势(图5)。经10 ℃驯化7 d的脐橙螟5龄幼虫体内繁殖的线虫S.carpocapsae收获后于10 ℃储存10 d和24 d的冷冻存活率分别为84.2%和90.5%，显著高于25 ℃驯化7 d的处理(72.5%和80.6%)(P<0.05)。经10 ℃驯化7 d幼虫体内繁殖的线虫S.feltiae收获后10 d和24 d的冷冻存活率为95.5%和92.8%，也显著高于25 ℃处理(83.8%和83.1%)(P<0.05)。即2种线虫经过低温驯化的寄主体内繁殖后其冷冻存活能力增强。

图5 昆虫病原线虫经低温驯化寄主体内繁殖后的冷冻存活率Fig.5 The frozen survival of EPNs reproduced by navel orangeworm acclimated at different temperatures

3 讨 论

快速冷驯化是物种对不利环境的一种迅速适应的表现。有研究报道，西花蓟马的若虫经快速冷驯化后，其耐寒性得到显著增强[16]。Zheng等研究结果显示，经历非致命的低温驯化有利于提高昆虫对低温胁迫的抗性[17]。黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)蛹后期至成虫期经过11 ℃的长时冷驯化，其耐寒性均显著提高[18]。生活在不同地理纬度的同种昆虫病原线虫以不同的低温驯化方式可以提高其耐寒能力[19]。目前还未见经低温驯化的寄主对其寄生线虫生物学特性的影响进行报道。市场上大多数制剂产品中昆虫病原线虫都不耐低温，虽然低温下线虫侵染力较差，但经历低温后的昆虫，如经过昼夜温差或季节温差后的昆虫对病原线虫侵染力、繁殖力和低温存活力有提高作用，对昆虫病原线虫可持续防治害虫有着重要意义。

本研究借助低温驯化的寄主昆虫(5龄脐橙螟幼虫)提高了S.feltiae对其致病力，2种昆虫病原线虫的侵染力、繁殖速度、产量和冷冻存活力，并且相对较耐低温的线虫S.feltiae生物学特性比S.carpocapsae更受低温驯化寄主昆虫的影响。所以该研究结果在昆虫病原线虫多个生物学特性指标对低温驯化寄主的反应方面属于首次报道。有学者总结了昆虫的冷驯化作用机制，如组织和细胞水平的特异性，低分子量抗冻保护剂的产生，热休克蛋白的表达及功能，以及阻止细胞程序性死亡的潜在机理等[20]。昆虫病原线虫经低温驯化过程体内生化物质(海藻糖和丙三醇等)的积累及变化利于线虫的冷冻存活[21-23]，但关于在低温驯化寄主昆虫体内繁殖后的昆虫病原线虫的生化物质积累是否有变化还有待于进一步研究。同时，昆虫的冷驯化作用机制对其寄生线虫又有怎样的影响还是未知。另外，不同种寄主昆虫经相同的低温驯化方式对同一昆虫病原线虫生物学特性的影响情况还不清楚，通过低温驯化寄主昆虫使昆虫病原线虫提高的耐寒性可维持多久及其机制需要深入研究。

4 结 论

线虫S.feltiae对10 ℃驯化7 d的5龄脐橙螟幼虫的致病力明显增强，S.feltiae和S.carpocapsae对10 ℃驯化7 d的的脐橙螟幼虫侵入力增强，且线虫S.feltiae在低温驯化寄主体内的繁殖速度加快。2种线虫在经低温驯化的昆虫体内繁殖后的产量均受寄主驯化温度影响，随驯化温度的降低线虫S.carpocapsae和S.feltiae产量呈明显上升趋势。经10 ℃驯化的寄主昆虫体内繁殖的2种线虫的冷冻存活率升高。10 ℃驯化7 d的5龄脐橙螟幼虫有助于提高S.feltiae线虫的致病力、侵入力、繁殖速度和产量及其冷冻存活力，提高程度较S.carpocapsae更明显。