逍遥散对慢性轻度不可预见应激抑郁大鼠行为学及食欲调节因子的影响❋

梁 媛，高静静，刘玥芸，岳利峰，黄晓华，甘大楠，东潇博，康 庆，康 杰，赵 歆△

(1. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 2. 北京中医药大学，北京 100029；3. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700； 4. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

抑郁症是一种常见的精神失调症状，表现为兴趣丧失、焦虑不安、恐惧、心情压抑等，随着现代社会压力的增大发病率逐年升高。目前抑郁症的发病机制未明。前期研究结果发现，慢性应激抑郁模型大鼠有食欲下降、体质量减轻、糖水消耗减少等快感缺乏和摄食异常表现，疏肝解郁名方逍遥散对此有明显的改善作用[1-2]。食欲降低、快感缺乏(兴趣丧失)是奖赏功能受损的重要表现。本研究以慢性轻度不可预见应激塑造抑郁症大鼠模型，观察模型大鼠血清多巴胺(DA)、食欲素-A(orexin A)与瘦素(leptin)的变化及逍遥散对其影响，从食欲与奖赏角度探讨逍遥散干预应激性抑郁的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

选用健康雄性(sprague-dawley，SD)大鼠60只，体质量180～220g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物许可证号SCXK(京)2016-0009)。于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物房适应性喂养3 d，自由进食与饮水。

1.2 中药及制备

实验所用的中药复方选用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散[3]。方药组成如下：柴胡15 g，当归15 g，白芍15 g，白术15 g，茯苓15 g，生姜5 g，薄荷5 g，炙甘草7.5 g。以上中药分别加10倍、8倍、8 倍水，煎煮3 次，过滤沉渣，浓缩，低温真空干燥为浸膏，粉碎，低温干燥备用。

1.3 应激易感大鼠筛选与分组

先对50只大鼠进行糖水训练。适应饲养第4天开始分笼孤养，每天1 h，连续9 d，禁食禁水12 h后给予1%蔗糖水和纯水各1瓶，记录糖水基线消耗量。第10天开始施加慢性不可预见应激因素，应激14 d后进行糖水测试。按测试结果将应激大鼠分为应激易感大鼠(糖水消耗下降40%以上)与应激恢复大鼠(糖水消耗未减少)。应激易感大鼠共筛选出30只纳入下一步实验，按随机区组方法随机分为慢性不可预见应激模型组和逍遥散组各15只。另外10只SD大鼠随机分为正常对照组，5只一笼群养。模型组与逍遥散组继续施加4周的应激因素。逍遥散组从第3周开始进行逍遥散药物干预。

1.4 造模方法

每周禁食禁水12 h，强迫冰水游泳10 min，夹尾3 min，束缚3 h(采用自制木质束缚架，底座长20 cm，宽9.5 cm。束缚台长18 cm，宽6.5 cm，高10 cm，两侧分别有适合四肢放置的凹槽及两条可调节的黏贴软带，用来固定大鼠的胸部和腹部。托板面钉有3条束缚带以固定大鼠)，潮湿垫料(300 mL 水泼入垫料中)24 h，热刺激10 min(Homecare电磁波治疗仪，40°)，白噪声刺激(90 db)6 h，7种应激因素中随机选择1种。模型组与逍遥散组连续造模共6周。

1.5 给药方法

逍遥散组从第3周开始进行逍遥散药物干预，灌胃时间4周。每天开始应激前30 min给药。逍遥散组灌胃逍遥散悬液(按人体用药量换算成大鼠5倍剂量，给药量为4.6125 g/(kg·d)，灌胃容积为1 mL/100 g体质量。模型组和正常组灌胃相同体积纯水。

1.6 行为学检测

1.6.1 一般状态观察 每日给药前，仔细观察大鼠的精神状态、姿势、皮毛色泽、活动度、对应激的反应性以及粪便等全身情况，每周测量各组大鼠体质量。

1.6.2 新环境进食压抑实验 造模结束第2天，大鼠禁食禁水12 h后，将大鼠放在等待室准备进行新环境进食压抑实验。使用规格为350×470×200 cm的全新透明鼠笼，笼盖投食处放置事先称量好的粉红色高脂饲料30 g。仔细观察15 min，记录由放入大鼠到大鼠前肢抱住食物开始的进食时间(进食潜伏期)和15 min内的进食时间。15 min结束后将大鼠取出，称出剩余饲料的重量并计算每只大鼠的进食量。潜伏期、进食时间和进食量均反映了大鼠的抑郁程度。

1.7 取材与指标检测方法

行为学实验结束后，第2天早上8∶00,将各组大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)后，仰卧固定于鼠板，剪开腹腔暴露腹主动脉，将无菌采血针一端刺入腹主动脉，另一端连接无菌3 mL真空采血管，待采血管满后拔出采血针。将采血管室温静置2 h后，离心10 min(4℃，12 000 g)，吸取上清液分装至冻存管内，编号标记后-80 ℃保存。酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠血清DA、orexin A、leptin含量，按试剂盒说明书进行操作。Rat DA ELISA Kit(武汉六合)，orexin A ELISA Kit(Phoenix)，Rat leptin ELISA Kit(Raybio)试剂盒均由北京百诺威生物技术有限公司提供。

2 结果

2.1 一般状态观察结果

造模6周结束时，正常组大鼠精神状态良好，活泼好动，体质量增长较快，皮毛洁白光泽，皮肤黏膜红润，球形粪便且干稀适中。模型组大鼠在造模过程中死亡1只，剩余14只大鼠神态倦怠，体质量减轻，毛发较少光泽，胡须下垂，耳廓色淡，活动减少或蛰伏在角落，大便多稀溏。逍遥散组大鼠因造模与灌胃等原因死亡5只，剩余10只大鼠，一般状态处于正常组与模型组之间。

2.2 各组大鼠新环境进食压抑实验测试结果

表1显示，与正常组比较，模型组大鼠体质量、进食时间与进食量比较均明显降低(P<0.01，P<0.05)，进食潜伏期明显延长(P<0.05)。表现出长期接受慢性不可预见应激，使模型大鼠对食物的兴趣下降，食物摄入减少是导致其体质量下降的重要原因之一。与模型组比较，逍遥散组大鼠体质量明显增加(P<0.05)，进食量有增长趋势但未见差异有统计学意义(P>0.05)，说明逍遥散具有一定的治疗作用。

2.3 各组大鼠血清ELISA检测结果

表2显示，与正常组比较，模型组大鼠血清DA 水平明显降低(P<0.05)，逍遥散上调作用极其显著(P<0.01)。血清leptin和orexin A含量方面，模型组均较正常组明显降低(P<0.05，P<0.01)，逍遥散组大鼠血清orexin A含量较模型组上升，差异有统计学意义(P<0.01)，逍遥散对模型大鼠血清leptin含量也有上调作用，但未见明显差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠新环境进食压抑实验结果比较

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05

表3 各组大鼠血清DA、orexin A、leptin含量结果比较

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01

3 讨论

抑郁症的核心症状包括快感缺乏、兴趣下降，是奖赏功能失调的具体表现，在大鼠可表现为进食、性行为和糖水消耗减少。正常的奖赏效应有利于个体适应外部环境，维持摄食、性等基本的本能行为。但奖赏功能一旦被异常激活，就会引起神经系统的慢性适应性改变，反而会对机体造成损害[4]。相对于药物奖赏，食物、水、金钱、音乐等被称为天然奖赏(natural reward)。天然奖赏的种类很多。 本研究选择从摄食方面进行观察，评价慢性轻度不可预见应激对大鼠在陌生环境下进食行为的影响。

有实验报道，慢性应激大鼠糖水实验结果并不稳定，考虑到可能与单只大鼠本身对慢性应激的易感性并不相同有关。故在本研究中，先对大鼠施加2周的慢性不可预见应激，通过糖水测试筛选出糖水摄入减少的“应激敏感型”大鼠，再进行造模，以期进一步提高抑郁大鼠模型的成功率。模型大鼠糖水摄入量减少，说明慢性应激造成实验大鼠对奖励反应有所下降，在此基础上通过新环境进食压抑实验进一步观察其对食物的敏感性。结果发现，模型组大鼠进食潜伏期明显延长，说明施加慢性不可预见应激因素对大鼠造成了负面影响，说明其对奖赏的反应性下降、兴趣降低，对周围环境的判断能力下降。进食时间与进食量均明显降低，表现出模型大鼠对食物的敏感性降低，食物摄入减少也是导致其体质量下降的重要原因之一。与模型组比较，逍遥散组大鼠体质量增加，进食量有所增长，说明逍遥散具有一定的治疗作用。本研究结果发现，逍遥散对慢性应激造成的大鼠摄食量减少有明显的上调作用，提示逍遥散的疏肝健脾功效对抑郁大鼠的情绪与食欲均有较好的调节作用。

现代医学研究认为，大脑神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、DA 等在神经突触间的浓度相对或绝对不足，是抑郁症发病的重要病理基础[4]。DA是大脑调节奖赏系统的主要神经递质，一系列的实验证明，几乎所有的长期抗抑郁治疗的患者都会增加DA诱导的奖赏反应[5]。本研究发现，与正常组比较，慢性轻度不可预见应激模型大鼠血清DA水平明显降低，结合行为学实验模型大鼠食欲降低的症状表现，可以认为通过施加慢性轻度不可预见应激因素造成的抑郁症大鼠模型，已经出现快乐体验能力降低的核心症状，提示造模成功。

食欲素(orexins)和瘦素(leptin)都是参与调节食欲和机体能量代谢的肽类物质[6]。leptin由成熟的脂肪细胞分泌, 经血液循环进入中枢神经系统,行为学、电生理学及临床研究发现，leptin缺乏将导致机体因摄食过量而肥胖，证明leptin是摄食调节和维持机体能量及代谢平衡的极其重要的影响因子[7]。orexins有刺激动物摄食作用，参与食物、性等自然奖赏过程，一种可能的解释是orexins调节奖赏与应激过程中的唤醒状态[8]。实验研究发现，orexins与下丘脑 leptin 存在相互作用,下丘脑外侧区 (LHA)的leptin通过作用于其受体调控orexins神经元的活性[9]。

食欲素可分泌orexin A 和orexin B 两种小分子多肽，目前研究较多的是orexin A, 其与摄食行为调控和肥胖发生密切相关[10]。本实验结果显示，长期接受轻度不可预见应激的大鼠血清orexin A水平较正常大鼠明显下降，作为一种剂量性依赖增加摄食的食欲调节因子，Orexin A 减少会导致模型大鼠对食物的渴求下降和进食减少，这可能是抑郁大鼠食欲下降与体质量降低的原因之一。实验结果还显示，长期接受轻度应激后大鼠血清中的leptin水平也出现明显降低。

leptin和orexin是两种相反作用的多肽，均作用于下丘脑，前者可使食欲下降、活动增加而减肥；后者则促进食欲，可能造成肥胖。有研究人员给予大鼠皮下注射orexin A后，其体内的leptin水平明显升高；注射leptin后，其体内的orexin A水平显著降低，说明leptin和orexin之间是相互影响的关系[11]。这两种中枢作用截然相反的因子在外周血中的含量均明显下降，可能说明慢性轻度不可预见应激模型中orexin与leptin间原有的平衡状态受到严重破坏，进而引起一系列本能需求减弱的抑郁样表现。

逍遥散始载于宋代《太平惠民和剂局方》，方由柴胡、当归、芍药、薄荷、茯苓、白术、生姜、甘草组成，功效疏肝解郁、健脾养血。本研究用疏肝解郁的名方逍遥散对慢性不可预见应激大鼠进行干预，发现其对血清DA、orexin A和leptin水平均有积极的上调作用，且能提高大鼠的进食量与体质量，进一步提示逍遥散具有确切的抗抑郁作用。

国外的研究表明，leptin缺乏的小鼠下丘脑弓状核DA水平下降。还有研究发现，leptin能抑制DA神经元的活动，DA在伏核水平下降，从而食物摄入减少[9]，这也与本研究结果一致。orexin是食欲促进因子，leptin是食欲抑制因子，二者均与抑郁导致的摄食异常、兴趣缺失有关，而这些行为的改变又与奖赏系统有着密切联系。当leptin-orexin在奖赏系统的调制失衡，则可能会引起DA释放减少，导致快乐体验能力缺乏。逍遥散可能通过调节orexin-leptin的平衡协调调整动机、情绪、认知等内环境的自稳态，进而激活DA的分泌，发挥其在奖赏过程中的保护作用。这可能是逍遥散抗抑郁的作用通路之一。至于orexin、leptin和DA三者之间的相互作用机制，尚待下一步研究发现。