维生素E治疗大鼠少弱精症的效果及作用机制的研究

乔辉，刘蔚，赫锦锦，王景春

（河南大学第一附属医院药学部，河南 开封 475001）

少弱精症是男性不育最常见的病因之一，由于其发病机制尚不清楚，因而对于少弱精症的治疗仍然处于探索阶段。目前临床常采用维生素E与其他药物联合治疗少弱精症[1]，取得了一定的效果，但是作用机制还不清楚。本实验采用雷公藤多甙诱导少弱精症的模型大鼠,系统地研究维生素E对大鼠精子的密度、活力、活率、直线运动速度等指标的影响,并探讨维生素E治疗少弱精症的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，初始体质量250～280 g，河南省实验动物中心提供，合格证号：0000713；许可证号SCXK（豫）2005-0001。饲料、垫料均由实验动物中心提供。在恒温21℃～24℃，相对湿度45%～50%的环境中适应饲养1周后实验。

1.2 药物及试剂

雷公藤多甙片（上海复旦复华药业有限公司，国药准字：Z31020415，规格：10 mg/片），使用前用0.9%氯化钠注射液稀释成混悬液灌胃。维生素E（天津市中央药业有限公司，国药准字：H12020262，规格：0.1g/粒）使用前用玉米油将其溶解后灌胃。兔抗大鼠HSP70-2(美国Epitomics公司)和小鼠抗大鼠GAPDH(北京中杉金桥生物工程公司)，山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物工程公司)。

1.3 主要仪器

精子分析系统(清华同方)，Mini-Protean Ⅱ型垂直板电泳槽（BIO-RAD公司），Power-Pac 200型电泳仪（BIO-RAD公司）冷冻离心机（德国Hettich公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组及给药

28只大鼠适应性饲养1周后按随机数字表法分为四组：正常对照组、模型组、溶剂治疗组和维生素E治疗组，各7只。根据参考文献，除正常对照组外，其他各组动物每日灌胃雷公藤多甙20 mg/kg，连续灌胃5周后，将正常组与模型组动物处死，取精子并检测精子密度、活力、活率、直线运动速度，与正常组大鼠相比判断模型是否建立成功，并取睾丸组织一小块置于-80℃保存，备用。造模成功后，维生素E治疗组每日灌胃150 mg/kg，连续给予5周，溶剂治疗组每日灌服等体积的玉米油。5周后，将动物处死，检测精子密度、活力、活率、直线运动速度以及各组HSP70-2蛋白在睾丸组织中的表达。

2.2 精子的采集及各项指标的分析

应用扩散法收集大鼠附睾尾精子，将左侧附睾取尾部放入盛有2 mL37 ℃0.9%氯化钠注射的培养皿中,剪开几处切口，37℃恒温水浴5 min，以便于精子充分游离出来，取10 μL加到预热至37 ℃的血细胞计数板上用于精子质量分析。采用计算机辅助精子分析系统（computer assisted sperm analysis，CASA）检测精子的密度、活力、活率、直线运动速度。

2.3 睾丸蛋白的提取以及Western blotting

取各组动物部分睾丸组织加入100μL RIPA裂解液（普利莱公司，中国），用研磨棒匀浆，此后样品继续在冰上裂解1小时后12 000 g离心10 min取上清，用BCA蛋白试剂盒（Pierce 公司，美国）定量。每组蛋白取60 μg变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移到PVDF膜上，用TBST配置的5%脱脂奶室温封闭1 h后孵育一抗：兔抗大鼠HSP70-2 （1∶500）和小鼠抗大鼠GAPDH（1∶1 000），4℃，过夜。第二天经过TBST液洗涤3次后孵育二抗（1∶2 000），室温1 h，再次经过TBST液洗涤3次后，通过ECL试剂盒（Pierce公司，USA）发光，显影，扫描并统计灰度值。

2.4 数据统计分析

采用Prizm 5.0 软件统计分析和处理数据，计量资料以“±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 四组精子各项指标比较

雷公藤多甙组大鼠精子的密度、活率、活力以及直线运动速度等指标低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；维生素E治疗组大鼠精子的密度、活率、活力以及直线运动速度高于溶剂治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 不同分组精子各项指标的统计分析

图1 雷公藤多甙组大鼠精子的密度（A）、活率（B）、活力(C)以及直线运动速度(D)

3.2 四组HSP70-2蛋白的表达

雷公藤多苷组大鼠睾丸中HSP70-2蛋白的表达低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；维生素E治疗组HSP70-2蛋白的表达高于溶剂治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 四组大鼠睾丸中HSP70-2蛋白的表达

4 讨论

少弱精症主要表现是精子数目减少，活力降低以及运动能力低下，是男性不育最常见的病因之一。本研究根据以往的文献报道，采用雷公藤多甙法成功建立了少弱精症大鼠模型，主要原理是雷公藤多甙可以干扰圆形精子细胞向精子转化[2-3]。维生素E为一种脂溶性维生素，研究报道，维生素E联合助育汤、维生素C、硫酸锌能明显改善精子的密度和活力[4]；对老年小鼠连续腹腔注射5周维生素E后，精子质量明显提高[5]。本研究结果显示，维生素E治疗组大鼠精子的密度、活率、活力以及直线运动速度显著高于溶剂治疗组，说明维生素E可提高精子质量，治疗少弱精症。那么维生素E是通过何种机制来治疗少弱精症的呢？

哺乳动物精子发生是一个独特而复杂的细胞分化过程，在该过程中，热休克蛋白HSP70-2作为一种应激蛋白，在正常生精过程中的持续存在并且阻止生精细胞发生凋亡,从而使生精细胞完成细胞周期，促进精子的形成[6]。如果睾丸组织中HSP70-2表达下调或者不表达（例如隐睾症患者），则生精细胞会发生凋亡，精子形成受阻，导致不育[7]。有文献报道，维生素E可上调HSP70-2蛋白的表达，提高睾酮水平[8]。本研究结果显示，雷公藤多甙诱导的少弱精大鼠睾丸组织中HSP70-2蛋白的表达与正常组比较明显下调，当用维生素E治疗后，HSP70-2蛋白的表达明显上调。证实维生素E治疗少弱精症是通过上调HSP70-2来实现的。

综合，维生素E可治疗少弱精症，作用机制可能是上调HSP70-2表达。