三七皂苷R1对心房颤动大鼠心肌炎症相关因子和金属基质蛋白酶表达的影响

2019-12-17康玲玲高端敏

中山大学学报(医学科学版) 2019年6期

康玲玲，高端敏

（河北医科大学附属唐山工人医院心内科四科，河北唐山 063000）

心房颤动致残率和致死率比较高，是临床常见的心律失常，心房电重构和结构重构是心房颤动的主要发病机制，因此心房颤动的治疗重点是抑制心房的电重构以及结构重构［1］。纤维化形式的心房结构重构是心房颤动发生发展的重要病理生理基础，抑制心房纤维化、干预心房重构进程是未来治疗心房重构的切入点［2］。细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）为心肌炎症相关因子，可导致心肌电重构和结构重构，增加交感神经密度，损伤心肌细胞膜，从而诱导心律失常的发生［3-4］。金属基质蛋白酶（metalloproteinase，MMP）和金属基质蛋白酶抑制因子（metalloproteinase inhibitor，TIMP）在心房颤动心肌纤维化的过程中发挥重要作用，MMPs是降解细胞外基质成分的主要蛋白水解系统，MMP2 和TIMP2 参与多种心血管疾病的发生，和心肌纤维化关系密切［5］。三七为我国的传统中药材［6］，三七总皂苷为三七主要有效成分，在心脑血管疾病的防治中具有重要作用，具有抗心律失常，具有防止心房颤动的发生和降低期前收缩的发生率［7］，但其作用机制尚不清楚。三七皂苷R1 为三七总皂苷的主要活性单体之一，本文对三七皂苷R1 对心房颤动大鼠血清和心房组织中ICAM-1、TNF-α、MMP2、TIMP2 的影响进行研究，探讨三七皂苷R1 防治心房颤动的机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及主要试剂

实验动物：12 周龄、健康、清洁级、雌雄各半、体质量190～240 g、SD 大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，按照《实验动物饲养和使用指南》对大鼠进行饲养，保持环境湿度为40%～70%，环境温度为21 ℃～25 ℃，大鼠进行常规喂养。动物许可证号：SCXK（京）2014-000。

主要试剂：三七皂苷R1（北京索莱宝生物科技有限公司），ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2 ELISA 试剂盒（美国Sigma 公司），Masson 试剂盒、RIPA 裂解液、免疫组化试剂盒（美国Abcam 公司），兔抗鼠MMP-2 多克隆抗体、兔抗鼠TIMP-2多克隆抗体、兔抗鼠ICAM-1 多克隆抗体、兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、兔抗鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体（美国Abcam 公司）等。

1.2 大鼠初筛

将SD 大鼠适应性喂养7 d 后，水合氯醛麻醉，生物信号采集处理系统（MwdLab-U/4C501H）描记心电图，记录标准Ⅱ导联，将大鼠尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙（0.1 mL/100 g），注射后大鼠心电图显示出现f 波、P 波消失、R-R 间期绝对不等的心房颤动心电图，则表示大鼠对乙酰胆碱-氯化钙敏感［8］。筛选出对乙酰胆碱-氯化钙敏感的大鼠102 只用于实验。

1.3 大鼠分组及心房颤动模型建立

将筛选的102 只大鼠根据随机数字法分为对照组、心房颤动组和三七皂苷R1 组，每组34 只。心房颤动组和三七皂苷R1 组大鼠建立心房颤动模型［8］：称取大鼠体质量，水合氯醛麻醉，生物信号采集处理系统记录大鼠标准Ⅱ导联，大鼠尾静脉注射0.1 mL/100 g 乙酰胆碱-氯化钙（含66 μg/mL乙酰胆碱和50 mg/mL 氯化钙），对照组大鼠尾静脉注射等量生理盐水，每天1 次，共3 d。3 d 用药结束后分析心电图，以心电图显示典型心房颤动心电图为心房颤动大鼠模型建立成功。建模结束后，对照组大鼠显示正常心电图，心房颤动组和三七皂苷R1 组均显示典型的心房颤动心电图，表示心房颤动模型建造成功（图1）。

1.4 各组大鼠处理

建立模型后次日（第4天），三七皂苷R1组大鼠腹腔注射2 mL 三七皂苷R1 水溶液（2.5 mg·kg-1·d-1）［7］，对照组和心房颤动组腹腔注射等量生理盐水；0.5 h 后，心房颤动组和三七皂苷R1 组大鼠尾静脉注射0.1 mL/100 g 乙酰胆碱-氯化钙，对照组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。各组取17 只大鼠用于心房颤动持续时间和心房组织Masson 染色及免疫组化染色测定，各组剩余17 只大鼠用于ELISA 及心房组织Western blotting 测定。

图1 正常心电图和心房颤动心电图表现Fig.1 ECG of normal and atrial fibrillation

1.5 心房颤动持续时间测定

记录大鼠第4 天三七皂苷R1 治疗前和用药结束2 h（治疗后）标准Ⅱ导联心电图，以出现典型心房颤动心电图（出现f 波、P 波消失）为心房颤动开始标志，以f 波消失、P 波出现、恢复窦性心律为心房颤动终止标志，心房颤动持续时间为心房颤动开始至心房颤动终止持续的时间。

1.6 心房组织病理学检查

大鼠心房颤动持续时间测定结束后，水合氯醛麻醉大鼠，开胸取出心脏，清洗干净后剪取心房组织，多聚甲醛固定3 d，经脱水、石蜡包埋。

Masson 染色：将心房组织石蜡切片脱蜡至水，滴加核染液染核60 s，蒸馏水冲洗，滴加浆染液染色60 s，滴加分色液分色8 min，加入复染液复染5 min，脱水后，经二甲苯透明、中性树胶封固。心肌组织被染成红色，心肌胶原纤维被染成蓝色。

免疫组化染色：取心房组织石蜡切片切除4 μm 切片，脱蜡至水，加入柠檬酸缓冲液修复抗原，加入过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶，加入正常山羊血清孵育20 min，加入一抗（兔抗鼠MMP-2多克隆抗体、兔抗鼠TIMP-2 多克隆抗体）过夜孵育，加入二抗孵育20 min，加入链亲和素-辣根过氧化物酶10 min，加入DAB 工作液5 min，加入苏木素复染5 min，加入盐酸酒精分化2 s，返蓝水洗2 min，脱水、透明、封片。显微镜下观察染色情况，包括阳性细胞的染色强度和染色面积，采用Image-pro llius 图像处理软件计算积分光密度值，每张切片选5 个高倍视野测定视野面积和记分光密度，计算光密度（平均光密度=积分光密度/视野面积）。

1.7 血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2水平测定

抽取大鼠尾静脉血3 mL，离心（2 000 r/min，r=20 cm）20 min，收集上清液，采用酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2和TIMP-2水平。

1.8 大鼠心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白水平测定

采用Western blotting 测定大鼠心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白水平，大鼠抽血结束后，水合氯醛麻醉大鼠，开胸取出心脏，清洗干净后剪取心房组织，将心房组织匀浆后加入裂解液，提取心房组织总蛋白，加入十二烷基硫酸钠缓冲液煮沸10 min 变性，经电泳、转膜、脱脂牛奶封闭，加入一抗唾液孵育，加入二抗孵育2 h，以β-actin 为内参。采用Image lab software 软件采集条带灰度值，以目标条带灰度值/β-actin 条带灰度值表示目标蛋白表达量。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行分析，大鼠心房颤动持续时间、血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2水平、心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白水平、心房组织MMP-2 和TIMP-2 蛋白光密度值符合正态分布，以均数±标准差表示，两组之间比较采用t检验两组比较采用成组t检验，治疗前后比较采用配对t检验，多组比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSDt检验，取P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三七皂苷R1 组对大鼠心房颤动持续时间的影响

三七皂苷R1 治疗前，两组心房颤动持续时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，三七皂苷R1 组心房颤动持续时间低于治疗前和心房颤动组（P＜0.05）；三七皂苷R1组治疗前后心房颤动持续时间差值高于心房颤动组（P＜0.05；表1）。

表1 心房颤动组和三七皂苷R1 组大鼠心房颤动持续时间比较Table 1 Comparison of duration of atrial fibrillation in model group and PN R1 group （，n=17）

1）Compared with Before treatment，P＜0.05

2.2 三七皂苷R1 对大鼠心房纤维化的影响

Masson 染色显示：对照组大鼠心房肌间质胶原纤维量正常，肌纤维和细胞质呈暗红死，无坏死灶；心房颤动组大鼠心房肌间质见融合状坏死灶内有大量胶原纤维；三七皂苷R1 组大鼠心房肌间质见片、点状胶原纤维（图2）。

2.3 三七皂苷R1 对大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2 水平的影响

与对照组比较，心房颤动组和三七皂苷R1 组大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 水平升高（P＜0.05），TIMP-2 水平降低（P＜0.05）；与心房颤动组比较，三七皂苷R1 组大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 水平降低（P＜0.05），TIMP-2 水平升高（P＜0.05；表2）。

2.4 三七皂苷R1 对大鼠心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白水平的影响

与对照组比较，心房颤动组和三七皂苷R1 组大鼠心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白水平升高（P＜0.05）；与心房颤动组比较，三七皂苷R1 组大鼠心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白水平降低（P＜0.05；表3、图3）。

图2 三组大鼠心房组织Masson 染色Fig.2 Masson staining of atrial tissue in three groups of rats

表2 三组大鼠血清ICAM-1、TNF-α、MMP-2 和TIMP-2 水平比较Table 2 Comparison of serum ICAM-1，TNF-α，MMP-2 and TIMP-2 levels in three groups of rats （，n=17）

1）Compared with control group，P＜0.05，2）compared with Model group，P＜0.05.ICAM-1：intercellular adhesion molecule-1；TNF-α：tumor necrosis factor-α；MMP-2：metalloproteinase-2；TIMP-2：metalloproteinase-2 inhibitor

表3 三组大鼠心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白水平比较Table 3 Comparison of ICAM-1，TNF-α and type I collagen levels in atrial tissue of three groups of rats （，n=17）

1）Compared with control group，P＜0.05；2）compared with Model group，P＜0.05；ICAM-1：intercellular adhesion molecule-1；TNF-α：tumor necrosis factor-α

2.5 三七皂苷R1 对大鼠心房组织MMP-2 和TIMP-2 蛋白表达的影响

免疫组化染色显示：心房颤动组和三七皂苷R1 组大鼠心房组织中MMP-2 阳性表达高于对照组，TIMP-2 阳性表达低于对照组；三七皂苷R1 组大鼠心房组织中MMP-2 阳性表达低于心房颤动组，TIMP-2 阳性表达高于心房颤动组（图4、5）。

与对照组比较，心房颤动组和三七皂苷R1 组大鼠心房组织MMP-2 蛋白光密度值升高（P＜0.05），TIMP-2 蛋白光密度值降低（P＜0.05）；与心房颤动组比较，三七皂苷R1 组大鼠心房组织MMP-2 蛋白光密度值降低（P＜0.05），TIMP-2 蛋白光密度值升高（P＜0.05；表4）。

图3 三组大鼠心房组织ICAM-1、TNF-α和Ⅰ型胶原蛋白Western blot 电泳图Fig.3 Western blot electrophoresis of ICAM-1，TNF-α and type I collagen in three groups of rat atrial tissue

3 讨论

心房颤动是最常见的心律失常类型，可导致心力衰竭和脑卒中等致残、致死性并发症的发生，对患者的生命健康和生活质量造成严重影响［9］。心房结构重构在心房颤动中起重要作用，心房纤维化、心房肌细胞超微结构变化、心房扩大是心房结构重构的主要表现，心房纤维化是心房颤动患者心房结构重构的最主要表现，是心房颤动发生的结构基础，抑制心房纤维化对抑制心房颤动具有重要作用［10］。胶原蛋白是心房组织细胞外基质的主要成分，在心肌成纤维细胞受到刺激时刻合成和分泌胶原，使胶原合成和胶原降解失去平衡，细胞外基质中胶原含量增加，胶原的大量聚集以及排列紊乱可造成心房纤维化的发生，Ⅰ型胶原蛋白在心房纤维化时合成和分泌异常增加，是心房颤动过程中细胞外基质中胶原含量升高的主要原因，细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白含量和心房纤维化程度关系密切［11］。本研究显示Masson 染色见对照组心房肌间质胶原纤维量正常，心房颤动组大鼠心房肌间质见融合状坏死灶内有大量胶原纤维，心房组织中Ⅰ型胶原蛋白含量高于对照组。表明心房颤动大鼠模型心房组织中存在明显纤维化。

图4 三组大鼠心房组织MMP-2 蛋白免疫组化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of MMP-2 protein in three groups of rat atrial tissue

图5 三组大鼠心房组织TIMP-2 蛋白免疫组化染色Fig.5 Immunohistochemical staining of TIMP-2 protein in three groups of rat atrial tissue

表4 三组大鼠心房组织MMP-2 和TIMP-2 蛋白光密度值比较Table 4 Comparison of optical density values of MMP-2 and TIMP-2 proteins in atrial tissue of three groups of rats （，n=17）

1）Compared with control group，P＜0.05；2）Compared with Model group，P＜0.05；MMP-2：metalloproteinase-2；TIMP-2：metalloproteinase-2 inhibitor

表5 小鼠血清脂质含量Table 5 Serum lipid，lipoprotein

ICAM-1 是一类存在于细胞表面的糖蛋白受体，具有促进细胞和细胞及组织基质之间的黏附作用，在血液中白细胞游出、黏附和浸润中发挥重要作用，可介导炎症反应，维护组织稳定，在损伤修复、血栓形成、免疫调节中发挥重要作用；ICAM-1 下心房颤动的发生发展中可导致心房的电重构和结构重构，诱发心房颤动的发生［12］。TNF-α由中性粒细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞、星状细胞等多种细胞产生，可损伤内皮细胞，抑制纤溶，促进凝血，促进血管平滑肌细胞增殖和迁移，促进单核细胞与内皮细胞的黏附。TNF-α和心房颤动关系比较密切，心房颤动心房组织中TNF-α水平升高，心房颤动心房组织中TNF-α高表达可影响胶原代谢，在心房间质纤维化过程中发挥重要作用，和心房颤动的发生及维持关系密切［13］。本研究显示：心房颤动组大鼠血清和心房组织中ICAM-1 和TNF-α水平升高，表明ICAM-1和TNF-α在诱导大鼠心房颤动的过程中发挥重要作用。

MMP-2 和TIMP-2 在组织纤维化过程中发挥重要作用，正常情况下MMP-2 和TIMP-2 处于平衡状态，维持正常的细胞外基质。在病理情况下，MMP-2 活性升高，表达量增加，降解正常的细胞外基质成分，合成异常结构和功能的结缔组织和胶原蛋白，导致组织重塑［14］。TIMP-2 是MMP-2的抑制剂，其作用和MMP-2 相反，可抑制MMP-2对细胞外基质成分的降解［15］，TIMP-2 和MMP-2的平衡决定心脏基质合成和降解处于平衡状态，在心脏结构和功能维持方面发挥重要作用［16］。本研究显示：心房颤动组大鼠血清和心房组织中MMP-2 水平升高，TIMP-2 水平降低，表明在大鼠心房颤动的形成过程中MMP-2 和TIMP-2 失去平衡，心房组织细胞外基质成分降解增加，异常胶原蛋白合成增加，从而导致心肌纤维化，引起心房颤动的发生。

三七是我国传统中药，为五加科草本植物三七的根，具有消肿止痛和活血化瘀功效。三七总皂苷是三七的有效活性成分［17］，对恶性肿瘤的发生发展具有抑制作用，对心肌缺血、高血压、动脉粥样硬化、脑血管疾病、心律失常等多种疾病具有预防和治疗作用［18-20］；可通过调节心肌组织中miRNA 的表达改善心房结构重构和电重构，从而预防心房颤动的发生［21］。三七皂苷R1 是三七总皂苷的活性单体，其对心脑血管等系统疾病具有防治作用。吴丹丹等对三七总皂苷对乙酰胆碱-氯化钙诱导大鼠心房颤动及期前收缩的干预作用进行研究，发现三七总皂苷可通过抑制血清IL-17A 水平抑制炎症反应而抑制乙酰胆碱-氯化钙诱导大鼠心房颤动及期前收缩的发生［22］。本文通过三七皂苷R1 对心房颤动大鼠血清和心房组织ICAM-1、TNF-α、MMP-2、TIMP-2 水平进行研究治疗，探讨三七皂苷R1 对心房颤动的可能作用机制，发现与心房颤动组大鼠比较，三七皂苷R1组大鼠心房颤动持续时间减少；心房组织中胶原纤维和Ⅰ型胶原蛋白含量明显减少，血清和心房组织中ICAM-1、TNF-α、MMP-2 水平降低，TIMP-2水平升高。表明三七皂苷R1 具有防治心房颤动的作用，其机制可能为三七皂苷R1 通过抑制心肌炎症相关因子ICAM-1、TNF-α，减轻对心肌细胞膜的损伤，降低交感神经密度，抑制导致心肌电重构和结构重构，从而抑制心房颤动的发生；三七皂苷R1 通过抑制MMP-2 表达，促进TIMP-2 表达，从而抑制细胞外基质降解，抑制心肌纤维化，从而抑制心房颤动的发生。

综上所述，三七皂苷R1 可能通过抑制心肌炎症相关因子ICAM-1、TNF-α表达，下调MMP-2 表达及上调TIMP-2 表达抑制心肌纤维化，从而对心房颤动发挥防治作用。