肝细胞癌超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白表达水平与肝癌恶性生物学指标的相关性

温春勇，孙文静，万 源，林 润，李 楠，山长亮，杨建勇，黄勇慧

（1.中山大学附属第一医院放射介入科，广东广州 510080；2.暨南大学生物医学转化研究院，广东广州 510632）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球发病率排名第五，死亡率位列第三的恶性肿瘤［1］。HCC 对各种治疗疗效反应欠佳，预后差，五年生存率低［2］。由于癌细胞的独特代谢模式，即便在氧气充足的情况下，肿瘤细胞仍以糖酵解途径提供能量，以满足其异常活跃的增殖代谢活动，即“Warburg 效应”［3］，肿瘤组织内产生大量活性氧物种（ROS）。肿瘤组织内ROS 和过氧化氢（H2O2）内稳态主要由铜锌-超氧化物歧化酶（copper-zinc superoxide dismutase，SOD1）维持［4］。而SOD1 的激活由超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白（copper chaperone for superoxide dismutase，CCS）介导［5］。CCS 是细胞质中SOD1 的铜伴侣蛋白，CCS 通过将铜离子插入到SOD1 铜结合位点的方式介导SOD1 的激活，激活的SOD1 催化超氧阴离子（O2-）歧化为氧气和H2O2［6］。癌细胞的生长、增殖都依赖于适度高浓度的H2O2，高活性的SOD1 维持癌细胞内较高水平的H2O2和ROS 内稳态［7］。许多实验数据表明，CCS 表达水平与肿瘤恶性生物学行为密切相关，包括肿瘤增殖、肿瘤血管生长及肿瘤对铂类耐药等方面［8-10］。此外，有许多生物学指标已经明确与肝细胞癌恶性生物学行为密切相关，如Ki-67，vimentin，CD34 及GPC3。然而目前很少有文章探究肝细胞癌中CCS 表达水平与肝细胞癌恶性生物学行为之间的关系。本研究旨在探讨CCS 表达水平与肝细胞癌恶性生物学指标表达水平之间的关系。

1 材料与方法

1.1 患者及标本

所有患者均已签署手术知情同意书，本研究取得中山大学附属第一医院伦理批准，伦理号为［2019］365 号。收集2018 年1 月至2018 年12 月在中山大学附属第一医院行外科切除术的10 例肝细胞癌患者的肝癌及癌旁组织，患者的临床和病理特征情况如表1 所示。所有患者均被诊断为患有HCC，患者术前均未曾接受过任何抗肿瘤治疗。术前肝功能分级采用Child-Pugh 评分系统；肿瘤病理分化程度采用Edmondson 分级系统［11］；肿瘤TNM 分期采用国际抗癌联盟TNM 分级标准第六版。肿瘤大小定义为病灶的最大直径。

1.2 实验试剂

兔抗人CCS 多克隆抗体（22802-1-AP）购自Proteintech 公司，羊抗兔二抗购自Abcam 公司，Phospho-AMPKα（Thr172），AMPKα 抗体购自Cell Signaling Technology 公司，β-肌动蛋白抗体购自Santa Cruz 公司；兔抗人Ki67 多克隆抗体（ZM-0165）、兔抗人vimentin 多克隆抗体（ZA-0260）、兔抗人CD34 多克隆抗体（ZA-0550）及GPC3 多克隆抗体（ZM-0146）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAKO-K5007 检测试剂盒购自Dako公司。

表1 肝癌患者资料Table 1 Statisticalinformation of HCC patients

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白免疫印迹 将所取组织捣碎研磨过200 目细胞网筛，制成细胞悬液后用预冷PBS 分别洗3 次，加入细胞裂解液（NaCl：1.5 mol/L，HEPES：

1 mol/L，pH 7.0，1% NP-40，Napyrophosphate：0.1 mol/L，NaF：0.1 mol/L，Na3VO4：0.1 mol/L 及蛋白酶抑制剂）冰上放置30 min，在离心半径8 cm，4 ℃条件下12 000 rpm/min离心20 min，取上清，测定蛋白质浓度。经12% SDS-PAGE，90V 湿转100 min至PVDF 膜，5%脱脂牛奶，室温封闭膜1 h，加入一抗：兔抗人CCS多克隆抗体（1∶1 000稀释）、β-肌动蛋白（1∶3 000稀释），4 ℃过夜孵育，TBST 每10 min洗膜一次，共洗膜3 次，加入羊抗兔二抗（1∶3 000 稀释），室温孵育1 h，洗膜，于暗室曝光，观察结果。用凝胶灰度分析软件Quantity One 4.6.6 检测蛋白电泳条带的灰度值，以β-actin 作为内参蛋白，目标蛋白条带与相应β-actin 的灰度值之比即为目标蛋白的表达水平。

1.3.2 免疫组化免疫组化步骤 采用DAKOK5007试剂盒。将切片放二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ微波炉中低火（P30）脱蜡各3 min，然后用100%酒精，95%酒精，80%酒精，50%酒精，蒸馏水依次各洗1 min，随后行抗原修复：把PH 9.0 或PH 8.0 的EDTA（检 测Ki67 及GPC3 时用PH9.0 的EDTA 修复；检测vimentin 及CD34 时用PH 8.0 的EDTA 修复）放高压锅里用电磁炉煮沸后，把脱蜡好的切片放进去，盖上盖子后把火力调到最大2 100 HZ，听到高压锅声响时把火力调到1 000 HZ，计时2 min 30 s，然后关掉电磁炉，打开高压锅盖，室温冷却30 min。蒸馏水洗1min，用吸水纸擦干组织周围的水分，用免疫组化笔画线；用PBS 缓冲液漂洗8 min，手工滴加一抗（Ki67 稀释比1∶200，CD34 稀释比1∶400，vimentin 稀释比1∶500，GPC3 稀释比1∶300），37 ℃恒温箱孵育50 min。用PBS 缓冲液漂洗8 min，再用3%的H2O2处理10 min（消除内源性过氧化物酶）。用PBS缓冲液漂洗8 min，滴加二抗DAKO（K5007），37 ℃恒温箱孵育30 min。PBS缓冲液漂洗8 min 后用DAB（稀释比为1：100）显色，显微镜下控制。水洗，复染苏木素3 min，盐酸酒精分化5 s（根据苏木素的着色能力来调整），碳酸锂回蓝10 秒，自来水冲洗10 min。烤干后用环保树胶封片。免疫组化染色结果由两名对临床资料不知情的病理科医生独立阅读和评分。Ki67，vimentin，GPC3 染色结果的判读采用免疫组化评分标准（IRS）［12］。每个切片随机选取5 个高倍镜（10×40）视野，根据阳性细胞所占比例及细胞质或细胞核内颗粒染色强度评分之积，作为评分结果。染色范围评分标准：无阳性细胞，0 分；阳性细胞百分比＜10%，1 分；10%～50%，2 分；51%～80%，3 分；＞80%，4 分。染色强度评分标准：无色，0 分；淡黄色，1 分；棕色，2 分；棕褐色，3 分。所得。染色范围评分与染色强度评分之积即为IRS得分，取5 个得分的平均值作为IRS 评分结果。CD34 染色结果采用Weidner 等［13］方法即采用微血管密度（microvascular density，MVD）计数：肝窦内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表1 条单独的微血管。先在低倍视野下（×40）观察切片全部视野，选取组织内血管密度最高的5 个区域，即“热点”（hot spot），再在高倍视野下（×200）分别计数这5 个视野的微血管数，取其平均值作为平均微血管数，即微血管密度MVD 值。由2 名病理医生采用双盲法分别对同一切片计数，取两者计数中较高的数据作为该切片的MVD 数据。

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0 软件对实验数据进行统计分析。采用Wilcoxon 秩和检验法对CCS 表达水平与各肝细胞癌恶性相关生物学指标Ki67，CD34，vimentin 及GPC3 表达水平之间的关系进行分析。CCS 表达水平与肝细胞癌患者临床及病理因素之间的关系之间的分析采用Fisher 精确概率法。P 值小于0.05 时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCS 在肝癌组织与癌旁组织的表达水平

为了明确CCS 在肝癌组织与癌旁组织中（图1）的表达情况，用蛋白免疫印迹的方法检测10 位肝癌患者肿瘤及相应癌旁组织的CCS 表达情况（图2）。多数患者肝癌组织CCS 表达水平低于相应癌旁组织（图3），其中7 例CCS 表达水平低于相应癌旁组织（图2A），3 例CCS 水平高于癌旁组织（图2B）。

2.2 CCS 表达水平与肝癌恶性生物学指标表达水平之间的关系

为了明确CCS 表达水平与肝癌恶性生物学指标表达水平之间的关系，采用免疫组化的方法明确肝癌组织中Ki67，vimentin，CD34 及GPC3 的表达水平（图4）。根据IRS 评分标准得出各肝癌组织Ki67，vimentin 及GPC3 免疫组化染色评分；采用Weidner 等的计数方法获得MVD 计数值。由散点图（图5）可知，CCS 高表达组的Ki67，vimentin及GPC3 的IRS 评分低于CCS 低表达组，具有统计学意义（Z=-2.400，P=0.016；Z=-2.423，P=0.015；Z=-2.400，P=0.016）；CCS 高表达组MVD高于CCS 低表达组，具有统计学意义（Z=-2.423，P=0.015）。

图1 肝癌大体标本及HE 染色结果Fig.1 Gross image and HE staining of hepatocellular carcinoma

图2 肝癌及癌旁组织CCS 蛋白免疫印迹法结果Fig.2 Image of CCS expression by Western blotting

图3 10 位患者CCS 表达情况Fig.3 CCS expression level in 10 patients

2.3 CCS表达水平与临床及病理特征之间的关系

CCS 表达水平与临床及病理特征之间的关系列于表2。根据CCS 表达情况将肝癌患者分为CCS 高表达组及CCS 低表达组。统计结果显示CCS 高表达组与低表达组之间在年龄、性别、乙肝病史、肝硬化、术前AFP 水平、肿瘤大小、ES 分级、微血管侵犯各临床及病理特征方面均未呈现显著统计学差异。

3 讨论

图4 肝癌恶性生物学指标免疫组化染色Fig.4 Images of immunohistochemical staining of biomarkers related to hepatocellular carcinoma

图5 CCS 表达水平与肝细胞癌恶性生物学指标表达水平的关系Fig.5 Correlation between CCS expression level and malignancy related biomarkers in hepatocellular carcinoma

表2 CCS 表达水平与临床及病理特征的关系Table 2 Relationship of CCS with clinical and pathological features

CCS 是细胞质中SOD1 的铜伴侣蛋白，CCS 将铜离子插入到SOD1 中促进二硫键形成从而激活SOD1；SOD1活性中心的铜离子得失电子从而实现将超氧阴离子（O2-）歧化为氧气和H2O2的过程［14］。在肿瘤组织中，由于“Warburg 效应”所致的高水平ROS 可以导致癌细胞死亡，SOD1 作为胞内重要的抗氧化酶，其活性对癌细胞的生长、增殖及生存都具有重要意义［4］。铜锌-超氧化物歧化酶（SOD1）的激活由CCS 介导，因而CCS 与肿瘤恶性生物学行为密切相关。已有研究显示，CCS 表达水平与肿瘤恶性生物学行为密切相关，包括肿瘤增殖、肿瘤血管生长及肿瘤对铂类耐药等方面［8-10］，但很少有研究明确CCS 表达水平与肝细胞癌恶性生物学指标表达水平之间的关系。

本研究结果显示大部分肝癌患者肿瘤组织中CCS 表达水平低于相应癌旁组织。这和以往研究报道的CCS 在其它肿瘤如肺癌、神经母细胞瘤及白血病的表达变化趋势明显不同，CCS 在H1299人肺癌细胞、K562 人髓系白血病细胞及212LN 人脑神经母细胞瘤细胞中的表达水平较正常细胞高，且在这些肿瘤细胞中CCS 高表达与肿瘤增殖活性密切相关［8］。因此，CCS 表达水平在不同类型肿瘤的表达趋势并非完全一致，其生物学机制及临床价值值得深入探讨。

为此我们纳入Ki67，CD34，GPC3 及vimentin等指标对比分析肝细胞癌CCS 不同表达水平间的差异。上述指标均为与肝细胞癌恶性生物学行为密切相关的生物学标记指标。Ki67 是标记细胞增殖的抗原，其在有丝分裂细胞中呈高表达，M 期达到峰值，而在G0 期细胞不表达［15］。Ki67 标记指数越高肝细胞癌分化程度越低，预后越差［16］。本研究显示CCS 低表达组的Ki67 表达水平高于CCS 高表达组（Z=-2.400，P=0.016），提示CCS 低表达组的肝细胞癌增殖活性较CCS 高表达组高；此结果与既往已有研究结果相反，有研究显示通过降低H1299 人肺癌细胞、MB231 人乳腺癌细胞及K562 人髓系白血病细胞内CCS 表达水平将抑制癌细胞增殖［8］，此结果提示与其他类型肿瘤相比，肝细胞癌中CCS 表达对增殖的影响存在一定的特异性。CD34 为血管内皮细胞的特异性标志分子，CD34 在肝癌组织中呈强阳性表达，而在正常肝窦内为阴性。在肝细胞癌中，CD34 计数结果即MVD 提示肝窦内皮化程度。本研究显示CCS高表达组的CD34 表达水平高于CCS 低表达组（Z=-2.423，P=0.015）。有研究显示CD34 表达水平越高，肝细胞癌预后越差，但其预测意义仅限于直径在5 cm 以内的肝细胞癌，而对直径大于5 cm 的肝细胞癌并无预测价值［17］，而在本研究中，大部分肝癌直径均大于5 cm。CD34 表达水平在本研究中的临床意义有待于收集更多直径小于5 cm 的标本行进一步研究。vimentin 是一种在间质中表达的Ⅲ型中间丝蛋白，其在上皮源性肿瘤细胞中异常表达，参与肿瘤的发生和转移过程，肝细胞癌中vimentin 的过表达对肿瘤复发、转移有显著预测效果［18］。本研究显示CCS 低表达组的vimentin 表达水平高于CCS 高表达组（Z=-2.423，P=0.015），提示CCS 低表达组的肝细胞癌患者较CCS 高表达组具有更高的肿瘤复发、转移风险。GPC3 是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白，其参与调节肿瘤细胞的增殖、分化、黏附和迁移等过程，其表达量与肝细胞癌预后呈负相关［19］。本研究显示显示CCS 低表达组的GPC3 表达水平高于CCS 高表达组（Z=-2.400，P=0.016），提示CCS 低表达组的肝细胞癌较CCS 高表达组肝细胞癌具有更高的恶性生物学行为。

综上所述，多数肝细胞癌的CCS 表达水平低于相应癌旁组织，并且与CCS 高表达的肝细胞癌相比，CCS 低表达肝细胞癌的Ki67，vimentin 及GPC3 表达水平较高，提示CCS 表达降低与肝细胞癌增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为相关。CCS低表达组CD34 表达水平低于CCS 高表达组，但CD34 表达水平的影响因素较复杂，其意义有待于进一步探究。

该研究存在一定局限性。首先，由于本研究样本量较小，本研究中CCS 高表达组与CCS 低表达组之间包括年龄、性别、乙肝病史、肝硬化、术前AFP 水平、肿瘤大小、ES 分级、微血管侵犯在内的临床及病理特征均未呈现统计学差异，未能明确CCS 与肝癌恶性相关临床病理特征的关联性。其次，由于患者术后时间不满一年，尚未能获得到完整预后相关数据（复发率、总生存期、无病生存期等），未能对CCS 表达水平与预后情况作统计学分析，因而没有获得CCS 与肝癌预后相关的直接证据。此外，本实验没有CCS 在肝细胞癌的发生与发展的直接证据。因此CCS 表达水平的临床意义还有待增加样本量并随访患者预后情况行进一步探讨，CCS 与肝细胞癌恶性程度相关的生物学机制有待于进一步研究。