RhoA在食管癌患者外周血中的表达与预后分析*

周益萍， 张健， 徐峰， 徐建峰， 朱成楚△

温州医科大学附属台州医院 1重症监护室， 2心胸外科(浙江台州 317000)

目前全球范围内，食管癌是最具致命性的肿瘤之一，预后不佳，病死率高[1-2]，居肿瘤相关性死亡第6位，最常见癌症第8位，且每年发生率呈递增趋势。食管癌的发生与多种因素有关，其中饮酒与吸烟是其危险因素，过多摄入盐渍和腌制食品也会增加食管癌发生的风险[3]。我国的食管癌患者中，食管鳞癌占了大约90%。早期食管癌的临床症状不明显，往往容易被患者忽视，此外，食管拉网细胞学检查、电子计算机断层扫描(CT)、超声内窥镜等检查技术对于早期食管癌缺乏有效诊断，所以大多数患者被初次诊断为食管癌时，病情极有可能处于晚期阶段。较早期诊断且经过规范治疗的食管癌患者80%～90%的5年生存率[4]，晚期或远处转移的患者低于15%[5]。因此，寻找能普查筛选或辅助诊断食管癌的生物标志物显得尤为重要。RhoA为Rho家族GTP酶的成员，在各种生物过程扮演了重要角色，尤其是在肿瘤的癌变和转移中起着重要的作用[6-7]，有研究表明降低RhoA的表达从而使得人类肺癌细胞的迁移与侵袭能力显著减弱[8]。有相关报道人类恶性肿瘤诸如肺癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌中存在RhoA的过表达[9]，mRNA水平表达的有肝细胞癌与睾丸癌[6]，越来越多的证据证明，RhoA mRNA和RhoA蛋白的表达与癌症的进展有密切关系[10]。本项目研究了食管癌患者外周血中RhoA mRNA的表达水平，并与健康人群相比较，探索RhoA作为食管癌肿瘤生物标志物的潜能。

1 资料与方法

1.1 患者与标本 采集2016年4月至2017年10月病理确诊为食管癌患者的血液标本41例，且患者基本生命体征包括体温、血压、血糖等都是在正常指标范围，未患有除食管癌外的其他炎症、慢性疾病、肿瘤等病患。所有患者均行胸腹腔镜下食管癌根治术，围术期无死亡。对照组为恩泽医疗集团体检中心随机选取与食管癌组患者年龄构成、性别占比相仿的健康人40例为对照组，各项实验室检查指标和生命体征都在正常范围内，并且他们无与食管相关的病变。研究中所有样本的取得都是经过患者的知情同意与医院伦理委员会的批准。两组一般情况差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

1.2 RNA的提取与qRT-PCR 根据TRIzol试剂(Ambion，美国)制造商的使用说明书进行全血标本总RNA的提取。简述之，将100 μL的血液标本与1 000 μL的TRIzol混分混合，再使用氯仿、异丙醇、乙醇等试剂进行总RNA的提取和沉淀，然后将沉淀用DEPC水重悬。使用分光光度计(Bio-Rad，美国)测定RNA的浓度和纯度。放置提取的RNA于-80℃冰箱存放备用。

cDNA制备：使用逆转录试剂盒(Thermo，美国)根据制造商的使用说明书进行RNA的逆转录，反应体系为20 μL，置于T100TMThermal Cycler (Bio-Rad，美国)仪器上进行反应。整个过程如下：RNA 1 μg，Oligo(dt) 1 μL，剩余用Water将体系调成12 μL，置于仪器中65℃，5～10 min。完毕后将其置于冰上，2 min内加入5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAid M-MuL V RT 1 μL，混匀后离心，将总的20 μL的体系置于仪器中42℃孵育60 min，70℃ 5 min，终止反应。最后将逆转录产物cDNA放于-80℃保存备用。见表2。

表1 两组的一般情况对比 例

表2 用于RhoA、GAPDH RT-PCR引物对的相关信息

RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应; GAPDH:甘油醛3-磷酸脱氢酶

RT-PCR：每孔反应体系构成，SYBR Green Mister(Rox) 2×(conc)10 μL，Forward Primer(10 mmol/L) 0.25 μL，Reverse Primer(10 mmol/L) 0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.5 μL，共20 μL体系。整个反应过程在7300 Real-Time PCR System(ABI，美国)仪器上进行。每个样本设置3个复孔。

为便于数据分析，RhoA mRNA在外周血中的表达水平通过GAPDH进行标准化。每个测定设置3个复孔。使用2-ΔΔCt法比较食管癌组与对照组、淋巴结未转移食管癌患者与对照组外周血中RhoA的相对表达量。

2 结果

2.1 食管癌组外周血中的RhoA mRNA的表达水平高于对照组 通过对qRT-PCR结果的分析来比较食管癌患者与对照组人群外周血RhoA表达水平的差异。食管癌组与对照组中均有RhoA mRNA的表达，且数据经过GAPDH标准化后显示食管癌组RhoA mRNA的表达量显著高于对照组(0.963±0.671vs0.393±0.127，P<0.05)。见图1。利用Younden指数的ROC曲线得到能区分食管癌患者与对照组人群的截断值。RhoA mRNA在敏感度为70.73%、特异度为100.00%时，最佳截断值为0.707，此时AUC为0.911(95%置信区间，0.810～0.969)。见图2。

图1 RhoA在食管癌患者及对照组人群外周血中的表达水平

图2 RhoA检测食管癌的ROC曲线

2.2 淋巴结未转移食管癌患者外周血中的RhoA mRNA的表达水平高于对照组 我们对淋巴结未转移的食管癌患者与对照组做了分析比较。标准化后的数据提示淋巴结未转移的食管癌患者外周血中RhoA mRNA的表达水平显著高于对照组(0.778±0.066vs0.393±0.127，P<0.05)。见图3。敏感度为78.57%，特异度为95%时，最佳截断值为0.734，这时AUC为0.900(95%置信区间，0.784～0.976)。见图4。

2.3 食管癌患者外周血中RhoA的表达水平与生命基本特征或肿瘤基本特征的关系 外周血中RhoA的表达水平与患者的年龄(P=0.098)、性别(P=0.546)、肿瘤部位(P=0.168)无显著关系。食管癌淋巴结转移与未转移患者RhoA表达的差异无统计学意义(P=0.773)。见表3、图5。

图3 RhoA在食管癌淋巴结未转移患者及对照组人群外周血中的表达水平

图4 RhoA检测食管癌淋巴结未转移的ROC曲线

临床病理特征例数全血中RhoA mRNA的表达P值性别0.546 男261.012±0.743 女150.878±0.537年龄0.104 ≤61岁150.738±0.305 >61岁261.093±0.788肿瘤部位0.168 中或者中上201.112±0.782 下或者中下210.821±0.526肿瘤类型0.507 鱗癌351.005±0.716 腺癌40.761±0.208 其他2/淋巴结转移0.773 是210.927±0.701 否141.014±0.770 未知6/

A:食管癌患者外周血RhoA表达水平与性别无相关性(P=0.546)。B:食管癌患者外周血RhoA表达水平与年龄无相关性(P=0.104)。C:食管癌患者外周血RhoA表达水平与肿瘤部位同样无相关性(P=0.168)

图5外周血中的RhoA的表达与食管癌患者性别、年龄和肿瘤部位无显著关系

3 讨论

食管癌患者无论局部或远处转移，其预后通常较差[11]。因此，普查筛选出食管癌患者尤其早期患者并进行有效的治疗对于其预后格外关键[12]。为了明确食管癌外周血中RhoA mRNA的表达是否可作为食管癌检测的潜在生物标志物，我们对41例食管癌患者与40例健康志愿者外周血RhoA mRNA的表达水平进行了qRT-PCR实验检测，并对结果进行了统计学分析。我们发现，食管癌患者外周血中RhoA的表达水平显著高于对照组的水平，并且与患者年龄、性别、肿瘤部位无相关性，其与肿瘤分化、淋巴结转移的关系需进一步的研究，这表明血液中的RhoA mRNA可作为食管癌普查筛选的潜在生物标志物，亦可作为辅助诊断食管癌的工具。

根据近些年的报道，食管癌患者中，癌组织中RhoA的表达水平较正常的食管组织有明显的升高[13-14]。本研究中，外周血中的RhoA mRNA的表达水平显著高于年龄、性别构成比相仿的健康人群，从ROC曲线结果分析，RhoA的最佳截断值为0.707，其敏感度为70.73%，特异度为100.00%，AUC为0.911，这些结果提示外周血RhoA能有效地鉴别食管癌患者与健康人群。

除此之外，我们进一步将食管癌淋巴结未转移患者与对照组进行了比较，结果发现前者外周血RhoA表达水平显著高于后者，最佳截断值为0.734，其敏感度为78.57%，特异度为95.00%，AUC为0.900，这揭示了外周血中的RhoA mRNA对食管癌淋巴结未转移患者能高敏感度检测到，普查筛选较早期的食管癌患者，对于其预后可能是重要的生物标志物[15-16]。

根据统计结果，我们发现外周血中RhoA的表达程度与患者的年龄，性别和肿瘤部位无相关性[17]，遗憾的是，我们的数据没能发现食管癌淋巴结未转移患者与转移患者RhoA的表达的差异，这可能与本研究样本量不够大有关。RhoA与肿瘤分化之间的关系有待进一步研究。

尽管肝细胞癌、膀胱癌、乳腺癌与一些颅内肿瘤中都有RhoA的表达[18]，食管癌患者外周血中的RhoA的表达也并非绝对特异性，但血液中RhoA mRNA的表达水平对普查筛选食管癌患者尤其可能的早期患者，这对于及时诊治改善预后和提高患者生存时间依然具有重要的指标作用[19],或许与其他生物标志物相一起进行预测更合理[15,20]。

总而言之，我们通过研究发现食管癌患者外周血中RhoA mRNA表达水平较健康人群高，且敏感性与特异性好，因此有可能作为食管癌的潜在生物标志物。经过进一步统计分析，发现食管癌淋巴结未转移的患者与对照组人群相比，RhoA mRNA高表达，差异有统计学意义，提示其具有作为筛选食管癌的参考指标的潜能。