草苁蓉环烯醚萜苷对SK-Hep1细胞EMT的抑制作用及其机制*

朱洁波， 董学花， 崔香丹， 金雪峰， 全吉淑， 尹学哲△

1延边大学附属医院呼吸内科(吉林延吉 133000)； 2延边大学医学院(吉林延吉 133002)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见、病死率最高的恶性肿瘤之一。目前，手术切除是治疗肝癌的主要方法，而肝癌的转移往往导致失去手术时机[1]，因此研究肝癌转移的机制，成为治疗肝癌的重点方向。而且邻近组织侵袭或转移到远处器官的特征，被认为是恶性肿瘤至关重要的特征。而侵袭和转移的过程，可能主要是因为癌细胞获得了上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的特性，从而更易向周围组织发生侵犯[2]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是介导肿瘤细胞发生EMT过程的重要因子，使上皮细胞获得间质细胞的特性，提高侵袭和迁移能力[3-5]。中药草苁蓉主要生长在我国的长白山地区，具有补肾、润肠通便、滋补强身功效。草苁蓉环烯醚萜苷(IGBR)是草苁蓉提取物中有效的药理成分，具有增强免疫力、抗应激、肝保护及抗肿瘤等功效[6-8]。2017年10月至2018年6月，本研究拟检测IGBR对TGF-β1诱导的SK-Hep1细胞EMT模型的影响，并探讨有关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人肝癌细胞SK-Hep1(中国科学院上海生命科学研究院)； IGBR(延边大学医学院全吉淑教授惠赠)；E-cadherin、N-cadherin鼠单抗及Vimentin兔单抗(CST公司)；HRP标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(纳川科技有限公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM(HyClone公司)；TGF-β1(Peprotech公司)；4%组织细胞固定液、结晶紫(索莱宝科技有限公司)；显微镜(Olympus公司)； Hang Cell Culture Inserts、PVDF膜(密理博公司)；电泳仪、Trans-Blot转印槽(Bio Rad公司)，电泳槽(北京六一仪器厂)，凝胶显像仪(Protein Simple公司)。

1.2 细胞培养及分组 人肝癌SK-Hep1 细胞株，将细胞复苏后置于10%胎牛血清DMEM培养液中，37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，48 h换1次培养液，取对数生长期细胞进行实验。将人肝癌细胞随机分成3组：对照组、模型组(TGF-β1组)和IGBR组。对照组为培养液处理，TGF-β1组为10 ng/mL TGF-β1处理48 h，IGBR组为10 ng/mL TGF-β1+500 μg/mL IGBR处理48 h。

1.3 实验方法

1.3.1 显微镜观察细胞形态学 显微镜下观察对照组、TGF-β1组细胞形态学改变。

1.3.2 划痕实验检测细胞迁移 6孔板中每孔加入1×106个SK-Hep1细胞，12 h后细胞贴壁取出6孔板，垂直板内划平行线后，换新的培养液及含500 μg/mL的IGBR培养液。分别在0、24和48 h显微镜下拍照记录。

1.3.3 Transwell检测细胞侵袭 上室加50 μL基质胶铺平，上室中加入2×105·mL-1的SK-Hep1细胞悬液100 μL。下室加入600 μL培养液，置于培养箱中继续培养。48 h后取出，4%组织细胞提取液固定20 min，0.5%结晶紫染色，显微镜下拍照记录。

1.3.4 Western blot检测各蛋白表达 提取细胞总蛋白后检测蛋白浓度，配置6%浓缩胶和10%的分离胶进行电泳，转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，分别加入1∶1 000稀释的一抗E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin，4℃过夜；加入1∶1 000稀释的二抗，室温下孵育2 h；在凝胶成像系统中曝光，分析各抗体条带灰度值。

2 结果

2.1 TGF-β1诱导前后SK-Hep1形态学变化 对照组细胞贴壁生长良好，可见卵圆形、多角形等不规则的上皮样形态；TGF-β1组细胞核变大，细胞多呈梭形，细胞数目增多。见图1。

A：对照组；B:TGF-β1组

2.2 IGBR对SK-Hep1细胞EMT模型迁移能力的影响 实验24 h时，与对照组相比，TGF-β1组发生迁移的细胞数增加(P<0.01)；与TGF-β1组相比，IGBR组发生迁移的细胞数减少(P<0.05)。实验48 h时，与对照组相比，TGF-β1组发生迁移的细胞数增加(P<0.01)；与TGF-β1组相比，IGBR组发生迁移的细胞数减少(P<0.01)。见图2、3。

图2 IGBR对SK-Hep1细胞EMT模型迁移能力的影响(×40)

*与对照组比较P<0.01；与TGF-β1组比较，△P<0.05，△△P<0.01

图3 IGBR对SK-Hep1细胞EMT模型迁移能力的影响

2.3 IGBR对SK-Hep1细胞EMT模型侵袭能力的影响 与对照组比较，TGF-β1组发生侵袭的细胞数增多(P<0.01)；与TGF-β1组比较，IGBR组发生侵袭的细胞减少(P<0.01)。见图4、5。

2.4 IGBR对EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin和E-cadherin表达影响 SK-Hep1细胞中，与对照组比较，TGF-β1组E-cadherin表达降低(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表达增加(P<0.01)。与TGF-β1组相比，IGBR组E-cadherin表达增加(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin表达降低(P<0.05)，见图6。

3 讨论

肝癌是全球重要的健康负担，每年约有84.1万新发病例和78.2万死亡病例。世界范围内大多数地区，男性的发病率和病死率更高，约高出女性的2～3倍。肝癌发生率最高的地区是东亚，其次是东南亚及非洲北部[9]。在中国，肝癌是第四大常见的恶性肿瘤，发生率仅次于肺癌、胃癌、结直肠癌。占中国恶性肿瘤死亡的第2位，仅次于肺癌。男性中，肝癌好发于44岁及以下，死亡以小于60岁者人数最多。而女性中，30岁以下肝癌的死亡人数最多[10]。

EMT与许多过程相关，包括胚胎发育、伤口愈合和组织修复以及肿瘤的迁移和侵袭等过程[11]。EMT是指在特定条件下，上皮细胞获得间质特性，使上皮间黏附性降低，细胞运动性增强，从而更易突破基底膜，向周围组织侵袭的变化。EMT不仅参与胚胎发育、组织修复、器官纤维化及肿瘤的发生发展，还参与肿瘤的迁移和侵袭等过程[12-13]。侵袭和转移邻近组织的过程，是恶性肿瘤的关键特征，这一过程主要依赖于具有癌细胞获得EMT特征[14]。本研究中，采用10 ng/mL的TGF-β1诱导人肝癌细胞SK-Hep1 48 h后发生EMT，这与文献报道的结果相似，即10 ng/mL的TGF-β1诱导肝癌细胞48 h，EMT效果最佳[15]。

A：对照组；B：TGF-β1组；C：IGBR组

*与对照组比较P<0.01；△与TGF-β1组比较P<0.01

参与EMT肿瘤进展和转移的标志物包括E-cadherin、N-cadherin和Vimentin[16]。E-cadherin在上皮细胞黏附和凋亡中起重要作用，其功能的丧失是癌症进展的主要原因[17]。N-cadherin是一种跨膜糖蛋白，即通常在神经黏膜和间充质衍生组织中表达，在许多过程中起的关键作用，如细胞-细胞黏附，细胞的迁移和侵袭[18]。N-cadherin被认为是EMT的重要标志。据报道，N-cadherin的表达，可以加速癌细胞的迁移和侵袭，这与癌细胞E-cadherin功能是相反的[19]。这种下调E-cadherin和上调的过程N-cadherin，被称为钙黏蛋白转换，是EMT的特征[20]。Vimentin在大多数细胞类型，特别是肿瘤细胞中显著表达[21]。发生EMT的肿瘤细胞，经历上皮标志物E-cadherin水平的降低，间充质标记物N-cadherin，Vimentin水平的增加。EMT标志物的表达预示着原发性肿瘤的进展和预后不良[22]。本研究观察了IGBR可以导致模型组E-cadherin表达量增加，减弱TGF-β1诱导SK-Hep1细胞侵袭转移及EMT的程度。

*与对照组比较P<0.01；△与模型组比较P<0.05

草苁蓉主要生长在我国的长白山地区，列属当科本草植物。近年来实验研究显示，草苁蓉具有抗应激、抗氧化、抗肝脏纤维化及肝保护的功效，同样在肝癌大鼠动物实验中，抑制了肿瘤的发展，提高肝癌大鼠的生存率[23-24]。IGBR是草苁蓉提取物中有效的药理成分，是抗肿瘤作用的重要化学物质之一[25]。本研究中，IGBR对TGF-β1诱导的人肝癌细胞株SK-Hep1的EMT模型迁移及侵袭能力的影响，并在显微镜下观察SK-Hep1观察TGF-β1诱导前后的细胞形态变化，划痕实验检测迁移能力，Transwell检测侵袭能力，Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达。

综上所述，500 μg/mL的IGBR可以抑制SK-Hep1细胞的迁移及侵袭，其机制可能与上调E-cadherin、下调N-cadherin和Vimentin有关。