菠菜乙醇酸氧化酶基因家族的鉴定及表达分析

武艺秀 郁征宇 葛晨辉 王全华 蔡晓锋

摘 要： 在菠菜全基因组中鉴定了菠菜（Spinacia oleracea L.）乙醇酸氧化酶（GLO）家族成员，并对其理化性质、亚细胞定位、基因结构、保守基序、同源关系及基因表达进行了分析，发现菠菜中存在5个SoGLOs蛋白，通过进化树分析，菠菜GLO蛋白与甜菜GLO蛋白亲缘关系较近.通过基因结构分析发现该家族基因由9～11个外显子构成.实时荧光定量聚合酶链式反应 （qRT-PCR） 结果表明：硝态氮仅能短期诱导SoGLOs的表达，而铵态氮可以持续抑制SoGLOs的表达，从而影响菠菜草酸的含量.在胁迫处理后，SoGLOs的表达均有明显变化，SoGLO1，SoGLO3和SoGLO5对盐胁迫的响应最明显，SoGLOs可能在菠菜的抗盐、耐高温、耐寒、抗旱以及抗氧化过程中起作用.植物激素的喷施普遍使SoGLOs的表达在短时间内增加，这可能引起菠菜体内草酸的快速积累.

关键词： 菠菜（Spinacia oleracea L.）; 乙醇酸氧化酶（GLO）; 逆境胁迫; 基因表达

中图分类号： S 636.1  文献标志码： A  文章编号： 1000-5137（2019）05-0557-09

Abstract： The spinach （Spinacia oleracea L.） glycolate oxidase （GLO） gene family members were identified from the whole genome of spinach，and their physical and chemical properties，subcellular localization，gene structure，conserved motifs，homology and gene expression were analyzed.Results showed that there are five SoGLOs proteins in spinach.The genetic relationship between spinachs GLO protein and those of Beta vulgaris L. protein was relatively close through phylogenetic tree analysis.Gene structure analysis revealed that the family gene consisted of 9 to 11 exons.Real-time quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） showed that nitrate nitrogen could only induce SoGLOs expression in a short period of time，while ammonium nitrogen could continue to inhibit the expression of SoGLOs，thus affecting the content of spinach oxalic acid.After stress treatment，the expression of SoGLOs changed significantly.SoGLO1，SoGLO3 and SoGLO5 responded most to salt stress.SoGLOs may play a role in the salt tolerance，high temperature tolerance，cold tolerance，drought resistance and antioxidant process of spinach.Spraying of phytohormones generally increases the expression of SoGLOs in a short period of time，which may cause rapid accumulation of oxalic acid in spinach.

Key words： spinach （Spinacia oleracea L.）; glycolate oxidase （GLO）; abiotic stresses; gene expression

0 引 言

植物會被各种病原体（包括病毒、细菌和真菌）感染，为应对病原体入侵，植物会产生许多应激反应来防御.对病原体感染最早的细胞反应之一就是快速产生活性氧（ROS），如过氧化氢（H2O2）或超氧阴离子（O2-）[1].在感染后，由NADPH氧化酶诱导使植物中ROS快速增加，其催化O2转化为超氧阴离子（O2-）.另一种产生ROS的途径是由乙醇酸氧化酶（GLO）介导的.GLO是光呼吸途径的关键酶之一，以黄素单核苷酸（FMN）为辅基的黄素依赖蛋白，能调节绿色植物中活性氧介导的信号转导[2].光呼吸过程中，乙醇酸从叶绿体转入过氧化物酶体，由GLO催化氧化成乙醛酸和过氧化氢.由于在光呼吸中执行了导致能量损失的关键步骤，因此它一直是作物改良的目标蛋白.除了在光呼吸作用中具有代谢功能外，GLO还可以在植物的光合作用调节和抗逆性中发挥作用.抑制GLO基因会导致乙醛酸积聚并抑制光合作用，而过表达GLO基因则可在强光和高温下提高水稻的光合作用[3].GLO已被证明参与植物对病原体的防御[4].植物对病原体的成功抗性反应常表现为过敏反应（HR），这是一种细胞程序性死亡，发生在病原体与植物相互作用的部位周围，这种细胞死亡可能也是由ROS生成引发的.西红柿光呼吸GLO产生的H2O2有助于防御丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae） [5].GLO的反应及产生的过氧化氢对植物适应干旱、盐害、重金属等非生物胁迫具有重要作用，并且对植物非寄主抗病性起重要调控作用.

GLO不仅能够催化乙醇酸氧化成乙醛酸，还能催化乙醛酸氧化生成草酸[6].CHANG等[7]研究表明GLO影响植物体内草酸盐的积累和调节.YU等[8]研究指出：光呼吸途径中的乙醛酸确实是草酸合成的有效前体物质.草酸在植物体中广泛存在，起着调节植物pH值，缓解重金属毒害，诱导抗病性，以及调节Ca2+浓度等作用.然而草酸会引起人体肾结石、高草酸血症等疾病.菠菜是一种高草酸含量的蔬菜，减少其草酸含量有助于提高其食用价值.

GLO是光呼吸途径的关键酶之一，对于减少菠菜中草酸的生成以及提高抗逆、抗病性有重要意义.本研究对菠菜GLO家族成员进行了生物信息学的分析，并研究了供氮形态、环境胁迫及植物激素对GLO基因表达的影响.

1 材料与方法

1.1 菠菜GLO蛋白的鉴定

在拟南芥种质信息（TAIR）数据库（http：//www.arabidopsis.org）中获得拟南芥AtGLOs（Glycolateoxidase）蛋白序列，在菠菜数据库（http：//www.spinachbase.org/？q=blast）中进行TBLASTN分析，得到菠菜GLO基因候选序列，同时对所获得的序列开放阅读框（ORF）.经筛选后的氨基酸序列再利用ScanProsite软件（https：//prosite.expasy.org/scanprosite/）和InterProScan软件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）来验证.

1.2 基因结构、蛋白保守序列及进化树分析

利用基因核苷酸编码序列与其相对应的基因组序列，通过Gene Structure Display Server（GSDS2.0，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）确定其基因结构.利用ExPaSy（http：//web.expasy.org/protparam）预测氨基酸数量、相对分子质量和等电点.使用MEGA7绘制进化树（NJ tree）.利用MEME Suite（http：//meme.sdsc.edu/meme/memeintro.html/）進行蛋白保守基序（motif）分析.在线使用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.hgc.jp/）对其蛋白序列进行亚细胞定位.

1.3 菠菜材料的处理与采样

供氮处理的实验材料为S14（高草酸积累型菠菜）和S104（低草酸积累型菠菜），来自上海师范大学植物种质资源工程技术研究中心.将种子播种于穴盘，以体积比例为1∶1的草炭土/珍珠岩为基质，在玻璃温室中育苗.

水培：选取长势一致的幼苗洗去根部基质，移至营养液（大量元素采用Hoagland配方，微量元素采用Arnon配方）中进行水培，营养液每3 d进行1次更换，并且每天对其pH值进行测量与调节，使其保持在5.8～6.0之间，水培菠菜置于人工气候室中，光照周期为10 h（光照）/14 h（黑暗），温度控制在21 ℃（光照）/18 ℃（黑暗），光照强度约为5 000 lx，湿度控制在71%左右.

盆栽：选取长势一致的幼苗连同基质移栽至培养钵中，放入托盘并从底部浇水，盆栽菠菜置于人工气候室培养，条件与水培菠菜相同.

培育2周后，再次选取长势一致的菠菜苗，进行后期处理.

供氮处理条件（水培）：15 mmol·L-1 NO3-;15 mmol·L-1 NH4+;7.5 mmol·L-1 NH4NO3;正常营养液配方（CK）.采样时间：经过0，3，6，12，24 h分别采样1次.

植物激素及抗坏血酸处理条件（盆栽）：喷施100 mmol·L-1 脱落酸（ABA）;赤霉素（GA）;乙烯利（ETH）;吲哚乙酸（IAA）;茉莉酸甲酯（Me-JA）;水杨酸（SA）;6-苄基胺基嘌呤（6-BA）;抗坏血酸（AsA）;对照（H2O）.使用喷壶对地上部分进行喷洒直至有水珠从叶片下滴.采样时间：经过0，3，6，12 h分别采样一次.

环境胁迫处理条件（盆栽）：模拟干旱（浇灌质量分数为20% 的PEG8000）;盐胁迫（浇灌400 mmol·L-1 NaCl）;氧化胁迫（喷施100 mmol·L-1 H2O2）;高温胁迫（40 ℃）;低温胁迫（4 ℃）.采样时间：经过0，3，6，12 h分别采样一次.

1.4 GLOs基因表达分析

使用Trizol法提取菠菜总核糖核酸（RNA），并使用NanoDropTM OneC分析RNA的浓度与质量.通过PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA（complementary DNA）模板.使用Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）进行引物设计.使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus）试剂盒在ABI7500上进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）.采用So18s基因作为内参，用2-ΔΔCt法计算相对表达量，用GraphPad Prism 7对结果进行作图.

2 结 果

2.1 菠菜SoGLO家族成员全基因组鉴定

在菠菜基因组数据库中利用4个拟南芥AtGLO蛋白序列进行TBLASTN分析，经过保守序列确认得到5个菠菜SoGLOs蛋白.将这5个蛋白基因分别命名为SoGLO1，SoGLO2，SoGLO3，SoGLO4，SoGLO5.SoGLO5相对分子质量为2.595×104，等电点为5.73，亚细胞定位预测在线粒体、叶绿体和细胞核.基因信息如表1所示.

菠菜SoGLOs基因的外显子数量为9～11个（图1），其中SoGLO1含有11个外显子，SoGLO2和SoGLO3都含有10个外显子，SoGLO4和SoGLO5含有9个外显子、8个内含子.

2.2 菠菜SoGLO家族蛋白保守基序分析

利用Pfam对菠菜GLO蛋白序列进行分析，SoGLOs属于FMN-dependent dehydrogenase家族.MEME对菠菜5个GLO蛋白序列进行分析，共鉴定了8个保守基序（图2）.

这些motifs的分布如图3所示：每个GLO蛋白中的motif数量在5～8之间，其中motif 1，motif 2，motif 3存在于所有蛋白中，其中motif 6都位于C末端.

2.3 菠菜和其他植物GLO蛋白系统发育分析

将SoGLOs与拟南芥、水稻、苜蓿、甜菜的部分GLO氨基酸序列进行比对，初步构建了NJ进化树（图4）.结果显示：SoGLO2与BvGLO1同源，相似度达99%;SoGLO3与BvGLO4同源，相似度98%;SoGLO1，SoGLO4与SoGLO5聚为一类，与BvGLO1.2，BvGLO4.2，BvGLO5同源，SoGLO1与BvGLO1.2相似度为90%，SoGLO4与BvGLO4.2相似度为98%.

2.4 供氮形态对菠菜GLOs表达的影响

SoGLO1在供氮处理24 h时均上调，其余时间点在铵态氮供给的104号材料中持续表现为下调.SoGLO2 在供氮处理1 h时均上调，在24 h的铵态氮供给条件下上调，而在24 h硝态氮供给时下调.SoGLO3 在104号材料各处理的1 h和3 h时上调，在同时供给硝态氮和铵态氮的情况下上调最高.SoGLO4 的表达模式和SoGLO3 类似.SoGLO5 在24 h供给硝态氮时下调，而在其他条件下下调（图5）.

2.5 环境胁迫对菠菜GLOs表达的影响

SoGLO1，SoGLO3 和SoGLO5 对盐胁迫的响应最明显，都呈现持续上调水平，其中SoGLO1的表达在盐胁迫12 h时达到对照的5.03倍.高温胁迫SoGLO2 和SoGLO5 的表达模式类似，都在1 h达到最高，随后逐渐降低，12 h降至低于对照水平（图6）.

2.6 植物激素及抗坏血酸对菠菜GLOs表达的影响

3 h和6 h时GA处理下的SoGLOs 均有小幅上调.6-BA处理1 h时，SoGLO1 和SoGLO3 均有明显上调，随后下降（图7）.

3 讨 论

光呼吸是指植物的绿色细胞在光照下吸收氧气释放二氧化碳的反应.GLO蛋白是光呼吸代谢中的重要酶，并且一直被认为在调控光合作用中有重要作用.此外GLO基因的表达会影响草酸的积累，光呼吸乙醇酸途径是草酸合成的主要途径之一.水稻基因组中预测有5个GLO基因.OsGLO1和OsGLO4主要在水稻叶片中表达，具有酶活（性）;OsGLO3主要在水稻根中表达，具有酶活;OsGLO5主要在水稻根中表达，不具有酶活;OsGLO1，OsGLO3和OsGLO4可以相互作用.水稻中GLO同工酶，受到OsGLO1和OsGLO4协同调控[9].浮萍中的草酸可以在没有GLO/光呼吸的黑暗或愈伤组织中积累[10].水稻中，草酸的积累并不依赖于光呼吸中的GLO，GLO对草酸的积累没有贡献[11]，但光呼吸途径中的乙醛酸确实是草酸合成的有效前体物质.

本实验通过对不同供氮形态下菠菜SoGLOs基因的表达水平研究发现：合成草酸的GLO在低草酸积累型菠菜提供铵态氮时的表达量都有所下调，但都在24 h时回升，其中SoGLO1最为明显;在完全硝态氮供给时，仅在1 h时出现上调，其余时间点的变化都不明显.由此推断，硝态氮仅能短期诱导SoGLOs的表达从而在短期内提高菠菜草酸的合成，而铵态氮可以持续抑制SoGLOs的表达，从而降低菠菜草酸的含量.高草酸积累型菠菜在铵态氮供给下，SoGLO2表达量在3～12 h时显著下调，说明铵态氮能抑制SoGLO2 的表达，而在24 h时表达量升高至12 h的3倍多，说明高草酸积累型菠菜通过提高SoGLO2表达量来增加草酸积累.在硝态氮铵态氮等比例供给条件下，SoGLO3表达量在高草酸积累型菠菜中变化不大，而在低草酸积累型菠菜中随时间逐步下降，24 h时表达量下降到不足原来的1/3，说明低草酸积累型菠菜通过显著抑制SoGLO3基因表达量来降低草酸含量.在低草酸积累型菠菜中，SoGLO4表达量在硝态氮供给时随时间逐步下降，6 h时约下降为原来的1/3，而在硝态氮铵态氮等比例供给时，3 h时约下降为原来的1/3，说明铵态氮会迅速抑制SoGLO4基因的表达.已经有一些氮素营养对植物体内草酸含量影响的研究.不同供氮水平会对植物草酸含量有显著影响.灯笼甜椒的草酸含量会随着供氮水平的提高而增加，高氮处理比低氮处理要高9倍[12].不同供氮形态也会影响植物草酸含量.西红柿的叶片、葉柄、茎，和根在供给硝态氮条件下草酸含量最高，供给尿素草酸含量次之，供给铵态氮草酸含量最低.西红柿叶片草酸含量供给硝态氮条件下比供给铵态氮高了5.1倍[13].水稻在硝态氮供给条件下可以诱导草酸的合成，在亚硝态氮供给条件下对草酸含量无显著影响，而供给其他氮源如铵态氮、尿素会降低草酸的含量[14].

随着GLO的表达增加，在将乙醇酸氧化为乙醛酸的同时，生成了更多的H2O2.H 2O2能作为信号分子调节相关反应，来应对逆境胁迫.GLO的表达增加，也会使植物草酸含量增加，草酸可以提高植物抗胁迫能力.草酸的合成可能是控制菠菜应激反应的一部分，其中相关基因的表达也能从一定层面上解释菠菜面对非生物胁迫时的反应机理.在高温胁迫下，与草酸合成相关的GLO基因SoGLO2，SoGLO4，SoGLO5的表达都出现了明显的升高，这可能意味着在高温胁迫下菠菜草酸的合成主要依赖于GLO进行.SoGLO1，SoGLO3 和SoGLO5 对盐胁迫的响应最明显，都呈现持续上调水平.干旱胁迫下SoGLO3和SoGLO5表达模式相似，1 h时表达升高，随后降低;6 h后表达水平升高.氧化胁迫下，SoGLO3和SoGLO5表达量先下降后升高，可能在氧化胁迫中起重要作用.在拟南芥细胞中草酸在臭氧诱导的信号传导中发挥作用[15].GLO催化生成的草酸可能是氧化胁迫诱导的信号传导途径的一部分，触发了程序性细胞死亡，从而提高植物抗逆性.低温胁迫下SoGLO2和SoGLO5都有显著变化，这2个基因可能与植物抗低温有重要关系.于婷婷[16]的研究指出，过量表达GLO基因的拟南芥在 NaCl 和 Mannitol 处理下的主根长度均高于对照，在 H2O2处理下的生长状况及叶片褪绿情况均好于对照，说明GLO能够在一定程度上提高拟南芥植株对盐、干旱及氧化胁迫的抗逆性.抗旱型小麦在干旱胁迫下旗叶和穗部GLO活性分别上升了42.3%和5.9%[17].GLO 在植物抗逆中发挥着重要作用.

植物激素的噴施普遍在短时间内引起GLO表达量的变化，1 h 6-BA，GA和IAA处理下的SoGLO1，SoGLO2和SoGLO3表达均出现上调，并在之后迅速回归正常水平，这可能是引起草酸加速积累的原因之一.SA处理后SoGLO2，SoGLO3，SoGLO4，SoGLO5表达先下降后升高.ABA处理后SoGLO2的表达变化最大，其表达水平在3 h时升至最高.植物激素可以通过参与信号转导途径来调控植物的生长发育.人参根中PgGLO 在ABA 和SA处理1 h后表达量上调 2.94倍和2.03倍，在随后48 h内表达量有下降，但都高于对照组[18].施用植物激素能引起GLO的表达量的变化，从而调控草酸的合成.

4 结 论

对菠菜基因组中鉴定出的5个GLO蛋白基因进行了基因结构、保守基序和进化关系分析.并且研究了不同供氮形态、环境胁迫和施用植物激素条件下菠菜SoGLO基因的表达情况.结果表明：供氮形态和施用激素会影响SoGLO的表达从而影响菠菜草酸的含量，菠菜SoGLO可能在抗盐、耐热、耐寒、抗旱以及抗氧化胁迫中起作用.

参考文献：

[1] BOLWELL G P，WOJTASZEK P.Mechanisms for the generation of reactive oxygen species in plant defence：a broad perspective [J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1997，51（6）：347–366.

[2] LIU Y，WU W，CHEN Z.Structures of glycolate oxidase from Nicotiana benthamiana reveal a conserved pH sensor affecting the binding of FMN [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2018，503（4）：3050-3056.

[3] ZHANG Z，LI X，CUI L，et al.Catalytic and functional aspects of different isozymes of glycolate oxidase in rice [J].BMC Plant Biology，2017，17（1）：135-145.

[4] ROJAS C M，MYSORE K S.Glycolate oxidase is an alternative source for H2O2 production during plant defense responses and functions independently from NADPH oxidase [J].Plant Signalling and Behavior，2012，7：752-755.

[5] AHAMMED G J，LI X，ZHANG G，et al.Tomato photorespiratory glycolate-oxidase-derived H2O2 production contributes to basal defence against Pseudomonas syringae [J].Plant Cell Environment，2018，41（5）：1126-1138.

[6] RICHARDSON K E，TOLBERT N E.Oxidation of glyoxylic acid to oxalic acid by glycolic acid oxidase [J].The Journal of Biological Chemistry，1960，236：1280-1284.

[7] CHANG C C，HUANG A H C.Metabolism of glycolate in isolated spinach leaf peroxisomes：kinetics of glyoxylate，oxalate，carbon dioxide，and glycine formation [J].Plant Physiology，1981，67（5）：1003-1006.

[8] YU L，JIANG J，ZHANG C，et al.Glyoxylate rather than ascorbate is an efficient precursor for oxalate biosynthesis in rice [J].Journal of Experimental Botany，2010，61（6）：1625-1634.

[9] ZHANG B，OAKES A D，NEWHOUSE A E，et al.A threshold level of oxalate oxidase transgene expression reduces cryphonectria parasitica-induced necrosis in a transgenic American chestnut （Castanea dentata） leaf bioassay [J].Transgenic Research，2013，22（5）：973-982.

[10] FRANCESCHI V R，NAKATA P A.Calcium oxalate in plants：formation and function [J].Annual Review of Plant Biology，2005，56 （1）：41-71.

[11] XU H，ZHANG J，ZENG J，et al.Inducible antisense suppression of glycolate oxidase reveals its strong regulation over photosynthesis in rice [J].Journal of Experimental Botany，2009，60（6）：1799-1809.

[12] ALONI B，KARNI L，RYLSKI I，et al.The effect of nitrogen fertilization and shading on the incidence of “colour spots” in sweet pepper （Capsicum annuum） fruit [J].Journal of Horticultural Science，1994，69（4）：767-773.

[13] KIRKBY E A，MENGEL K.Ionic balance in different tissues of tomato plant in relation to nitrate urea or ammonium nutrition [J].Plant Physiology，1967，42：6-14.

[14] TIAN H，JIANG L R，LIU E，et al.Dependence of nitrate-induced oxalate accumulation on nitrate reduction in rice blades [J].Physiologia Plantarum，2008，133：180-189.

[15] TRAN D，KADONO T，MOLAS M L，et al.A role for oxalic acid generation in ozone-induced signalization in Arabidopis cells [J].Plant Cell and Environment，2013，36：569-578.

[16] 于婷婷.擬南芥glycolate oxidase1基因的克隆及功能研究 [D].哈尔滨：黑龙江大学，2013.

[17] 张鑫.水分亏缺对小麦光呼吸及乙醇酸氧化酶活性的影响 [D].杨凌：西北农林科技大学，2013.

ZHANG X.Effects of water deficit on photorespiration and glycolate oxidase activity in wheat [D].Yangling：Northwest A&F University，2013.

[18] PARVIN S，PULLA R K，KIM Y J，et al.Isolation and characterization of glycolate oxidase gene from Panax ginseng C.A.Meyer [J].Journal of Ginseng Research，2009，33（4）：249-255.

（责任编辑：顾浩然）