纽荷尔脐橙微量元素缺乏症状及其叶片光合日变化特性

周高峰，李碧娴，林华珍，管 冠，刘桂东，姚锋先，钟八莲

（赣南师范大学生命科学学院/国家脐橙工程技术研究中心，江西赣州 341000）

我国是世界重要的柑橘生产国之一，其中脐橙在国内外柑橘生产中占有重要地位。我国脐橙主要集中在赣南—湘南—桂北一线以及长江三峡等地区，这些地区地理和土壤条件一般较差，甚至存在显著的缺素现象[1-5]。柑橘微量元素缺乏通常发生在新开垦或土层较浅的脐橙园，尤其是砂壤土和碱性土壤柑橘园[6-7]。对柑橘微量元素缺乏的研究较多，尤其是关于Fe、B、Zn 等缺乏的研究[8-10]。如目前种植面积和产量均居全国第一的赣南脐橙产区[11-12]，其主栽的纽荷尔脐橙长期受到土壤缺B 的影响，缺B 比例高达87.1%[4]。王男麒等[13]对赣南地区223 个代表性柑橘园进行背景土壤分析发现，26.0%背景土壤出现缺Cu 现象。另外，范玉兰等[5]对1405 个赣南脐橙园土壤样本进行有效Cu 含量分布特征研究发现，极缺和缺乏的脐橙园样本数为331 个，占样本总数的23.6%。从叶片诊断角度，凌丽俐等[3]对赣南地区的9 个县 (市、区)121 个脐橙园的脐橙叶片微量元素进行了分析，结果表明，有95.0%的脐橙叶片Zn 含量处于低量或缺乏水平；赣县和会昌县脐橙园叶片Cu 含量主要处于低量水平，分别占55.6%和100.0%；信丰县脐橙果园则表现为叶片Mn 缺乏，Mn 含量处于低量水平的县 (市、区) 还有南康市、章贡区、大余县和会昌县。与其他果树一样，纽荷尔脐橙叶片的光合能力是产量和品质形成的基础，其干物质的90%以上来自于叶片的光合产物[14]。而微量元素能直接或间接地参与光合作用，其缺乏对叶片的光合特性会产生显著影响[15]。其影响通常比叶面症状更早，因此可以作为微量元素缺乏早期诊断的依据之一。

本研究以赣南脐橙主栽品种纽荷尔脐橙为试材，通过砂培盆栽缺素试验，研究目前在脐橙生产上常见的缺Fe、Mn、B、Zn 和Cu 现象。首先，通过观察记录缺Fe、Mn、B、Zn 和Cu 在不同处理时间和植株不同部位的症状，进一步明确纽荷尔脐橙缺素在不同阶段的症状。其次，通过研究缺Fe、Mn、B、Zn 和Cu 条件下的光合特性，找到早期缺素的特征曲线。通过以上两方面的工作，以期为田间缺素症状的早期诊断提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验于2016 年11 月至翌年9 月在国家脐橙工程技术研究中心基地温室进行。以2016 年4 月嫁接的1 年生枳 [Poncirus trifoliata (L.) Raf.] 砧纽荷尔脐橙 [Citrus sinensis (L.) Osb. CV. Newhall] 幼苗为材料。

选取生长在相同育苗基质中相对一致的纽荷尔脐橙幼苗，每株小苗保留1 个抽梢，将该梢的叶片定义为老叶，同时对植株根系进行重剪 (促进植株多发须根[16])。然后，用自来水清洗苗木除去根表面的污渍，将植株移栽至装有8 L 左右石英砂和珍珠岩1∶1 (v∶v) 的黑色塑料盆中，每盆一棵。用略有修改的Hoagland No.2 营养液[17]浇灌。营养液的配方如下:6 mmol/L KNO3、4 mmol/L Ca(NO3)2、1 mmol/L NH4H2PO4、2 mmol/L MgSO4、25 μmol/L H3BO3、9 μmol/L MnCl2、0.8 μmol/L ZnSO4、0.3 μmol/L CuSO4、0.01 μmol/L H2MoO4和 50 μmol/L Fe-EDTA。大棚的温度控制在22℃～28℃，相对湿度为50%～75%。每2 天浇灌1 次营养液，每次均浇透，即营养液有约500 mL 从盆底流出。

试验设置5 个处理和1 个对照。对照 (CK)，1/2 剂量Hoagland 和全剂量Arnon 营养液栽培；缺铁 (-Fe)，不添加Fe-EDTA 的1/2 剂量Hoagland 和全剂量Arnon 营养液栽培，下同；缺锰 (-Mn)，不添加MnCl2，添加相同浓度的KCl；缺硼 (-B)，不添加H3BO3；缺锌 (-Zn)，不添加ZnSO4；缺铜(-Cu)，不添加CuSO4。每组重复5 株。培养到1 个月左右的时候植株开始抽新梢，待新梢长势稳定后每株植株保留2 个新梢，将新梢的叶片定义为新叶；处理6 个月后再保留一次抽梢，其叶定义为次级新叶。试验持续10 个月。为了防止盐分在基质中累积，每周用10 L 去离子水浇灌植株，而后用3 L营养液浇灌，确保有过量溶液从盆底淋出[18]。

1.2 测定方法

利用佳能 (Canon)EOS 6D (W) 数码单反相机，对不同处理的纽荷尔脐橙症状叶片进行拍摄记录。处理6 个月后，选取各处理有症状的纽荷尔脐橙老叶和新叶各6 片进行叶绿素含量的测定，具体参考Zhou 等[19]的方法进行。

采用美国LI-COR 公司生产的LI-6400XT 便携式光合测定系统，于2017 年4 月22 日进行光合测定，当天晴朗无云，日出时间为5:50:37，日落时间为18:46:56，日照时长为12 小时56 分钟16 秒。测量时间从7:00 到18:30，每1.5 或2 小时测定1 次。光合有效辐射 (PAR)、大气温度 (Tair)、田间二氧化碳浓度 (Ca)、相对湿度 (RH)、净光合速率 (Pn)、蒸腾速率 (Tr)、胞间二氧化碳浓度 (Ci) 及气孔导度 (Gs) 等参数由光合仪同步测定并记录，所测定的叶片每株选取老叶6 片，新叶6 片，每个处理测定4 株，待LI-6400XT 系统稳定之后，每片叶读取5 个瞬时各参数值，取平均值。

1.3 统计分析

除非特别说明，图表中的数据代表4 株单独植株 (重复) 的平均值。采用统计学软件SPSS 22.0 对所得数据进行环境因子之间相关性分析，得到皮尔森相关系数，并进行显著性检验。所有数据采用SAS软件进行分析，运用ANOVA 和DONCAN 程序进行不同处理之间的差异显著性分析 (SAS 8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)，显著水平为P ＜ 0.05。所有数据使用Sigmaplot 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 纽荷尔脐橙不同微量元素缺乏的症状

以枳砧纽荷尔脐橙为材料进行不同微量元素缺乏处理，分别观察其在处理6 个月和10 个月后的地上部症状。如图1 所示，缺铁 (-Fe)6 个月后纽荷尔脐橙初级新叶先显症状，叶片呈黄绿色，叶脉保持绿色，呈细网状叶脉；10 个月后次级新叶完全失绿呈白色或淡黄色，叶脉也呈白色。缺锰 (-Mn) 同样在初级新叶先显症状，叶淡绿呈细小网纹，脉间浅绿，在主脉和侧脉间现不规则浅色条带；10 个月时次级新叶呈黄色或灰白色，叶脉间现不透明褐色斑点，并停止生长。缺硼 (-B) 则是老叶先显症状，处理6 个月时老叶不黄化，叶脉 (主脉和侧脉) 轻微突起，触摸感较强；10 个月后老叶叶脉严重爆裂同时伴有脉间轻微黄化，初级新叶叶片显著增厚变硬，初级新梢茎尖新芽簇生，但均不能抽生次级新梢，植株停止生长。缺锌 (-Zn) 处理6 个月时初级新叶先显症状，呈现斑驳黄化；10 个月后次级新叶簇生、叶片严重变窄变小，有的叶片甚至出现畸形症状。缺铜 (-Cu) 纽荷尔脐橙6 个月后，初级新叶先显轻微症状，叶色深绿，叶面凹凸不平；-Cu 处理10 个月后次级新叶叶脉弯曲成弓状，叶色变淡，枝条细长而柔软，扭曲下垂，顶端易枯死。

2.2 不同微量元素缺乏处理对纽荷尔脐橙叶片光合色素含量的影响

图 1 缺素培养6 个月 (Ⅰ) 和10 个月 (Ⅱ) 后纽荷尔脐橙叶片微量元素缺乏症状Fig. 1 Symptoms of ‘Newhall’ navel orange leaves after 6 months (Ⅰ) and 10 months (Ⅱ) of nutrient deficient treatment

如图1- (Ⅰ) 所示，不同微量元素缺乏6 个月后，纽荷尔脐橙老叶或初级新叶出现不同程度的失绿，光合色素含量测定结果表明:与对照 (CK) 相比，老叶中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素的含量均无显著差异 (图2)。在初级新叶中，-Fe、-Mn 和-Zn 显著降低了其叶绿素a 的含量，但-B、-Cu 无显著影响；对于叶绿素b 和类胡萝卜素的含量则只是在-Fe 的条件下显著下降；总叶绿素含量则只在-Fe、-Mn 和-Zn 处理时显著下降，且下降幅度为-Fe ＞ -Mn ＞ -Zn 处理；类胡萝卜素的含量则在-Zn 处理时最高，-Fe 处理则显著下降 (图2)。

2.3 不同微量元素缺乏对纽荷尔脐橙叶片光合日变化的影响

2.3.1 环境因子日变化 由图3 可知，光合有效辐射 (PAR) 日变化呈单峰曲线，9:00—15:00 PAR 值均在1000 μmol/(m2·s) 以上，13:00 时出现最高峰，达到1607 μmol/(m2·s)。大气温度 (Tair) 的变化趋势与PAR 相似，也成单峰曲线，7:00 时最低，然后急剧上升，13:00 时达到最高温度33.9℃，之后降低。Tair与前一时间点的PAR 之间r=0.892，相关性达到显著 (P ＜ 0.05) 水平 (表1)。

7:00 时田间CO2浓度 (Ca) 出现最高值为447 μmol/mol，随后不断下降，在18:30 时略有回升。相对湿度 (RH)7:00 后急剧下降，13:00 达到最低值为29.8%，然后呈缓慢回升趋势。Ca和RH 的变化趋势均呈倒钟型，二者相关性分析r=0.898，达到极显著(P ＜ 0.01) 水平。Ca和RH 与Tair的相关性极显著，r 值分别为-0.876 和-0.997(P ＜ 0.01)(表1)。

因此，在4 个与纽荷尔脐橙光合作用相关的环境因子中，PAR 为驱动因子，在其他因子的变化中起主导作用 (表1)。

2.3.2 净光合速率 (Pn) 日变化 图4 结果显示，在纽荷尔脐橙CK 的新叶和老叶中，Pn日变化的趋势均为单峰曲线，峰值出现在9:00 时，为10.6 和8.7 μmol/(m2·s)。微量元素缺乏处理后，-B 处理显著改变了老叶的Pn日变化的趋势，另外推迟了-Zn 处理峰值出现的时间。在新叶的峰值 (9:00) 时，-Fe、-Mn 和-Zn 处理显著降低了Pn的峰值，虽然此时对-B 和-Cu 处理的Pn无显著影响，但在11:00 时有显著下降。在老叶的峰值 (9:00) 时，-B 处理显著降低了Pn的峰值。

图 2 纽荷尔脐橙缺乏不同微量元素新、老叶片叶绿素及类胡萝卜素含量Fig. 2 Chlorophylls and carotenoid contents in the new leaves and old leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiencies

图 3 光合有效辐射、大气温度、田间二氧化碳浓度和相对湿度日变化Fig. 3 Diurnal variation of photosynthetic active radiation (PAR), air temperature (Tair), field CO2 concentration (Ca)and relative humidity (RH)

Pn日均值结果显示，与CK 相比，-Fe、-Mn 和-Zn 处理显著降低了新叶的Pn日均值，降幅达60.0%、24.5%和28.9%，但对-B 和-Cu 处理新叶无显著影响。在老叶中，则是-Fe 和-B 处理显著降低了其Pn日均值，降幅分别为19.9%和85.9%，-B 处理纽荷尔脐橙老叶净光合速率已经接近停止 (表2)。

表 1 环境因子之间相关分析Table 1 Correlation analysis among environmental factors

图 4 纽荷尔脐橙缺乏不同微量元素新、老叶片净光合速率 (Pn) 日变化Fig. 4 Diurnal variation of net photosynthetic rate (Pn) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

表 2 纽荷尔脐橙缺乏不同微量元素新、老叶片光合特性日均值比较Table 2 Comparison of photosynthetic traits in new leaves and old leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

图 5 纽荷尔脐橙缺乏不同微量元素新、老叶片蒸腾速率 (Tr) 日变化Fig. 5 Diurnal variation of transpiration rate (Tr) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

图 6 纽荷尔脐橙缺乏不同微量元素新、老叶片胞间CO2 浓度 (Ci ) 日变化Fig. 6 Diurnal variation of intercellular CO2 concentration (Ci ) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

2.3.3 蒸腾速率 (Tr) 日变化 如图5 所示，CK 及微量元素缺乏处理的纽荷尔脐橙的新叶Tr日变化的趋势均为双峰曲线，除-Fe 处理首峰出现在11:00时，其他首峰均出现在9:00 时，次峰出现在15:00；老叶中除-B 外均为单峰曲线，但从9:00 至13:00时变化较平缓。在新叶的首峰 (9:00) 时，Tr值在-Fe 和-Zn 条件下被显著抑制，CK 9:00 至11:00 时变化平缓，但除-B 处理外，其他处理均在11:00 时显著下降。-B 处理的老叶Tr值从测定开始到结束始终维持在较低水平，且显著低于对照。其他处理的老叶Tr值则与对照无显著差异。

如表2 所示，Tr日均值仅在-Fe 处理的新叶和-B 处理的老叶中显著下降，降幅分别为24.6%和41.6%，其他处理新叶和老叶与CK 相比均无显著差异。

2.3.4 胞间二氧化碳浓度 (Ci) 日变化 从图6 可知，与田间CO2浓度变化趋势相似 (图3)，除-B 处理的老叶外，所有对照与处理的Ci日变化趋势均呈现先下降后升高的趋势，并达到峰值。Ci值受影响最显著的分别是-Fe 处理的新叶和-B 处理的老叶，其他处理与对照比较差异不显著。

纽荷尔脐橙Ci日均值仅在-Fe 处理的新叶和-B 处理的老叶中与CK 相比显著升高，升幅为18.7%和35.3%，其他处理均无显著差异。

图 7 纽荷尔脐橙缺乏不同微量元素新、老叶片气孔导度 (Gs ) 日变化Fig. 7 Diurnal variation of stomatal conductance (Gs ) in old leaves and new leaves of ‘Newhall’ navel orange with micronutrients deficiency

2.3.5 气孔导度 (Gs) 日变化 图7 结果显示，Gs日变化在CK 的新叶中呈双峰曲线，老叶中则为单峰曲线，首峰均出现在9:00 时，分别为148 和126 mmol/(m2·s)，新叶次峰出现在15:00 时，为69 mmol/(m2·s)，且次峰值低于首峰值。微量元素缺乏处理后，新叶中仅有-Zn 处理次峰消失，-Mn 和-B 处理的老叶中则在15:00 时出现了次峰。在新叶的首峰 (9:00) 时，除-B 和-Cu 处理外其他处理的Gs值均显著低于对照，而在次峰 (15:00) 时，只有-Fe、-B 和-Zn 处理的Gs值显著低于对照。在老叶的首峰 (9:00) 时，只有-B 处理的Gs值显著低于对照。

新叶中Gs日均值在-Fe 和-Zn 处理时与对照相比显著下降，下降幅度为29.9%和21.7%；在老叶中-Fe 和-Zn 处理表现为显著上升，但在-B 处理时表现为显著下降，下降幅度达59.6%(表2)。

3 讨论

3.1 柑橘微量元素缺乏的症状

柑橘微量元素缺乏通常发生在新开垦或高地下水位或高度沙化或钙化的柑橘园[6-7]。Fe 作为叶绿素合成中酶或辅酶的活化剂直接参与叶绿素的形成，因此-Fe 最典型的症状就是新叶的退绿[20]。本研究的结果表明，-Fe 处理6 个月后纽荷尔脐橙初级新叶先显症状，叶片呈黄绿色，叶脉保持绿色，呈细网状叶脉；10 个月后次级新叶完全失绿呈白色或淡黄色，叶脉也呈白色 (图1)。这与前人在枳、香橙、红桔等柑橘类果树中的报道相似[8,21]，但本研究的结果能清晰明确地看到不同级别新叶的缺Fe 症状及差异(图1)。Mn 虽然不直接参与叶绿素的合成，但是对维护叶绿体膜结构起着至关重要的作用[22]，因此缺Mn 柑橘叶片会在幼叶出现脉间失绿的症状，但在田间通常出现症状较晚且容易被缺Fe 或缺Zn 的症状所掩盖[7]。本研究通过砂培盆栽试验，明确地观察到了这一症状，且进一步获得缺Mn 严重时的症状，即次级新叶呈黄色或灰白色，叶脉间现不透明褐色斑点 (图1)。

关于柑橘缺B 的研究较多且典型症状稳定，主要表现为叶脉的爆裂和生长点的坏死 (植株低矮)[19,21]，但本研究除观察到上述症状外，还获得了初级新叶叶片显著增厚变硬、初级新梢茎尖新芽簇生但均不能抽生次级新梢的症状 (图1)，类似症状在其他植物中也有报道，但在柑橘中则鲜有报道。Zn 是植物体内许多酶的组成成分和活化剂，并能有效的促进光合作用。柑橘缺Zn 在田间通常表现为斑驳失绿(mottle-leaf)[7]。柑橘缺Zn 的典型症状是除斑驳黄化外，还有叶小而簇生呈莲丛状 (rosette)、节间缩短、植株矮小；如有结果则果实小而畸形，果皮厚，果肉木质化[22-23]。本研究在纽荷尔脐橙-Zn 处理6 个月时初级新叶便呈现典型的斑驳黄化，在10 个月后，则观察到新叶簇生、叶片严重变窄变小，有的叶片甚至出现畸形症状 (图1)。柑橘缺Cu 初期症状表现为叶片大、深绿色，有的叶形不规则，主脉弯曲，腋芽易枯死[24-25]。本研究发现纽荷尔脐橙缺Cu 6 个月后，初级新叶先显轻微症状，叶色深绿，叶面凹凸不平；缺Cu 10 个月后次级新叶叶脉弯曲成弓状，叶色变淡，枝条细长而柔软，扭曲下垂，顶端易枯死 (图1)，这与前人的研究基本一致。

3.2 柑橘微量元素缺乏与光合特性的关系

微量元素缺乏影响柑橘叶绿素合成的同时对叶片光合作用也有显著影响。柑橘为C4植物，因此通常情况下柑橘的Pn日变化呈双峰曲线，但受品种、砧木和外界环境条件的影响。如琯溪蜜柚净光合速率 (Pn) 的日变化的首峰出现在上午的8:00—10:00时，次峰出现在14:00 时以后，而在温州蜜柑中首峰出现在上午10:00 时，次峰出现在13:00 时以后[26-27]，且阴天时次峰会消失。作为纽荷尔脐橙优良芽变的桂脐一号，在嫁接不同砧木时其Pn日变化呈现为单峰、双峰甚至多峰现象[28]。本研究结果表明Pn日变化在对照的新叶和老叶中均呈单峰曲线，峰值出现在上午9:00 时，但是微量元素缺乏处理后，如-B 处理显著改变了老叶的Pn日变化趋势，另外-Zn 处理推迟了峰值出现的时间(图4)。徐春丽等[29]通过砂培进行缺Zn 试验，同样表明在缺Zn 胁迫条件下“不知火”叶片的净光合速率 (Pn) 日变化呈单峰曲线，对照则为双峰曲线。因此，微量元素缺乏可以改变柑橘的Pn日变化的趋势。

许多研究表明微量元素能够直接或间接影响植物的光合特性[30]。凌丽俐等[31]研究表明，早期的缺Zn 和潜在的缺Zn(低Zn) 会明显降低柑橘的光合效率。另外徐春丽等[29]报道缺Zn 降低了柑橘叶片叶绿素、Pn、Tr和Gs。本试验结果同样表明，纽荷尔脐橙幼苗在缺Zn 条件下其叶片净光合速率、蒸腾速率和气孔导度在新叶中受到显著抑制 (图4～图7，表2)。虽然B 不直接参与植物的光合作用，但是在缺B 条件下甜橙会在叶片中积累大量非结构物质的CO2，从而反馈抑制叶片的光合作用[32]。

4 结论

纽荷尔脐橙微量元素缺乏前期和后期的症状有较大差异。缺Fe 前期初级新叶呈黄绿色，后期次级新叶完全失绿呈白色或淡黄色，叶脉也呈白色；缺Mn前期初级新叶脉间现不规则浅色条带，后期次级新叶呈黄色或灰白色，叶脉间现不透明褐色斑点；缺B 前期老叶叶脉轻微突起，后期老叶叶脉严重爆裂同时伴有脉间轻微黄化，初级新叶显著增厚变硬，初级新梢茎尖新芽簇生；缺Zn 前期初级新叶斑驳黄化，后期次级新叶簇生、叶片严重变窄变小；缺Cu 前期初级新叶叶面凹凸不平，后期次级新叶叶脉弯曲成弓状，叶色变淡，枝条细长而柔软，扭曲下垂，顶端易枯死。叶片光合特性研究表明，-Fe、-Mn 和-Zn 处理的新叶和-B 处理的老叶有显著的峰值和变化趋势特征，而-Cu 处理的无显著特征。