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水体中孔雀石绿液相色谱-荧光法检测前处理方法的改进研究

2019-12-13李秀霞刘孝芳孙协军罗巧玲

关键词:孔雀石苯磺酸乙腈

李秀霞,刘孝芳,王 珍,孙协军,罗巧玲

(1. 渤海大学 食品科学与工程学院, 辽宁 锦州 121013; 2. 辽宁华鸿检测技术服务有限公司, 辽宁 锦州 121013)

0 引言

孔雀石绿(Malachite green,MG)是一种三苯甲烷类化合物,在水生物体中的主要代谢产物是隐性孔雀石绿(LMG),孔雀石绿和隐性孔雀石绿的结构式见图1所示,隐性孔雀石绿不溶于水,残留毒性比孔雀石绿更强.孔雀石绿一直作为重要的工业原料和治疗水产动物水霉病的有效药物,但由于孔雀石绿及其代谢产物-隐性孔雀石绿的高毒性、高残留和致畸、致癌、致突变作用.在我国,禁止在水产养殖中将孔雀石绿作为消毒剂使用〔1〕,但近年来,在鲜活鱼虾药物残留的检测中,孔雀石绿时有检出〔2,3〕,水体的污染是孔雀石绿检出的主要原因之一,因此,研究水体中痕量孔雀石绿残留的检测方法是必要的.

图1 孔雀石绿(MG)和隐性孔雀石绿(LMG)的结构式

水体中孔雀石绿经提取和净化后,采用光谱或色谱仪器检测〔4,5〕.隐性孔雀石绿的最大吸收波长为267 nm,背景干扰严重,因此,传统的液相色谱检测方法中采用二氧化铅柱后氧化法将隐性孔雀石绿氧化为孔雀石绿进行检测〔6〕.桂英爱等〔7〕采用乙腈和二氯甲烷混合溶剂多次萃取海水中孔雀石绿,二氧化铅柱后氧化法测定,但柱后氧化法对pH要求严格,操作难度高,且存在隐性孔雀石绿被分解的危险〔8〕,此方法逐渐被液相色谱-荧光法〔9〕、拉曼光谱法〔10〕,液相色谱-质谱法〔11〕,甚至超高压液相色谱法〔12〕等新型检测方法取代.随着检测方法的发展,国内许多学者对于水体孔雀石绿的提取及净化方法也进行了改进研究.液相色谱-质谱检测法所需样品前处理方法简单,但仪器成本昂贵.相比于水产品,养殖水体中孔雀石绿残留检测的前处理方法简单得多〔13〕,冯敏铃等〔14〕对养殖水中孔雀石绿提取净化时是否采用固相萃取柱进行了研究,发现前处理不过任何萃取小柱净化,回收率也有70%,但考虑到复杂水体中各类杂质的影响,作者建议提取液经过净化处理.但由于其残留量很低,如何避免孔雀石绿在前处理中损失是建立水体孔雀石绿残留检测的关键.基于这一研究前提,本实验在已有研究的基础上,建立简单、可靠且回收率高的水体中孔雀石绿及其残留检测的液相色谱/荧光检测方法.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

孔雀石绿草酸盐(纯度>98%,北京保乐吉生物科技有限公司),PRS柱(美国赛分科技有限公司,500 mg/6 mL).DG-12B型固相萃取装置(上海皓庄仪器有限公司);1260液相色谱仪(美国安捷伦公司);KQ500E超声波清洗器(上海舒美超声波仪器有限公司).

1.2 样品的提取与净化

1.2.1 提取

准确量取20 mL待测池塘养殖水样于离心管中,分别加入2 mL提取液(含对甲苯磺酸0.024 mg/mL,盐酸羟胺0.3 mg/mL)和10 mL有机溶剂,5 μg/mL孔雀石绿标准溶液10 mL,1 mL二甘醇溶液,剧烈振摇后,静止10 min,收集下层溶液于梨形瓶中,上层液体再重复萃取1次,合并有机溶剂层,35 ℃旋转蒸发至近干,向梨形瓶中加入2 mL乙腈和1 mL1%硼氢化钾溶液,旋涡混合2 min,备用.

1.2.2 净化

先用5 mL乙腈分两次活化PRS柱,将梨形瓶中溶液上样,将1.2.1中所得溶液过PRS柱,将PRS柱抽至近干,用3 mL pH 4.9的乙腈-0.1mol/L乙酸铵溶液(1:1,v/v)洗脱,接收于5 mL刻度管中,定容至3 mL,最后用0.45 μm滤膜过滤,备用.

1.2.3 色谱分析

具体色谱分析条件参照李秀霞(2016)〔15〕报道,采用XB-C18色谱柱分离后,荧光检测器检测.

2 结果与分析

2.1 孔雀石绿标准曲线的绘制

图2是浓度为0.5 mg/L孔雀石绿标准溶液的液相色谱图,由图2可知,孔雀石绿出峰时间为14.408 min.图2中目标物质的色谱峰峰形尖锐且对称、附近无干扰峰,分离效果良好.孔雀石绿标准溶液回归方程为y=195.32x-0.75,线性范围为0.002~1.0 mg/L,相关系数r2=0.9999,线性拟合良好.

2.2 提取剂的选择

GB/T19857-2005在水产品孔雀石绿残留的提取过程中加入了对甲苯磺酸和盐酸羟胺两种试剂,其中对甲苯磺酸酸性很强,作为离子对试剂,增加孔雀石绿在有机溶剂中的溶解能力,而盐酸羟胺作为还原剂,可防止孔雀石绿及其代谢产物的氧化降解.冯敏铃等〔14〕实验结果表明,是否加入盐酸羟胺和对甲苯磺酸对水体中孔雀石绿回收率的影响不大,而桂英爱等〔7〕和马瑞欣等〔13〕都是直接采用二氯甲烷和乙腈的混合有机溶剂提取水体中孔雀石绿和隐性孔雀石绿,在未加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺的条件下,取得很好的回收率.作者在前期实验中也发现,加入盐酸羟胺对杂质较少的自来水中孔雀石绿加标回收率影响不大,而对增氧的鱼缸水中孔雀石绿回收率的影响较大.因此,在1.2.1所述提取方法基础上,对甲苯磺酸和盐酸羟胺提取剂和有机溶剂的体积不变,考查是否加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺及不同有机溶剂对孔雀石绿回收率的影响,实验重复三次,结果如表1所示.从表1可以看出,以二氯甲烷为提取溶剂时,是否加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺对孔雀石绿的回收率影响不大,而用乙腈做提取剂时,不加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺显著降低了孔雀石绿的回收率(p<0.05),这可能与乙腈的极性相对较高有关,离子对试剂的加入增加孔雀石绿在乙腈中的溶解能力,而采用乙腈或乙腈/二氯甲烷(1:1, v/v)作为提取溶剂时,溶液不易分层,因此在分液漏斗中加入了1 mL二甘醇溶液.由于本实验水体杂质较多,呈绿色,为保持其中孔雀石绿等药物残留在运输和贮藏过程中的稳定性,采取加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺提取剂,同时采用乙腈/二氯甲烷(1:1, v/v)作为提取溶剂提取水体中孔雀石绿.

图2 孔雀石绿标准品的色谱图

表1 不同提取剂和提取溶剂对孔雀石绿回收率的影响

2.3 净化方法的选择

在已有的水体孔雀石绿净化方法中,多使用PRS、MCX、中性氧化铝小柱等作为固相萃取小柱使用,孔雀石绿的回收率在70%以上,经固相萃取柱净化后,样品纯度基本能满足液相色谱-荧光检测法的要求〔14,15〕.氧化铝小柱可吸附油溶性杂质,而中性氧化铝柱净化后孔雀石绿的回收率不高〔16〕,PRS、MCX、酸性氧化铝小柱净化后的孔雀石绿回收率均超过70%,而未经任何固相萃取小柱净化的孔雀石绿回收率也在70%以上〔7,13〕.在2.2优化出的提取方法的基础上,采用1.2.2方法对样品进行了净化处理,孔雀石绿的加标回收率为77.8%(见表1).不经过PRS柱净化的处理组中,直接将梨形瓶中的3 mL溶液用0.45 μm膜过滤后进样检测,得到孔雀石绿的回收率为78.11%,比经固相萃取后的样品略有提高,但差异不显著(p>0.05).鉴于复杂水体中藻类、淤泥等复杂基质的影响,实验室中用于检测孔雀石绿的色谱柱在使用五六个月后柱效就明显降低,在不经过固相萃取净化的情况下,大约三个月左右色谱柱柱效就明显降低,因此,如果是检测池塘水等复杂水体,还是需要对样品进行必要的固相萃取净化处理,而如果是地下水、自来水等较干净的水样,可不经过固相萃取净化直接进样.

2.4 孔雀石绿检出限和回收率的测定

参照2.3和2.4优化出的样品前处理方法,准确量取20 mL待测池塘养殖水样于离心管中,分别加入2 mL提取液(含对甲苯磺酸0.024 mg/mL,盐酸羟胺0.3 mg/mL)和10 mL有机溶剂(1:1乙腈/二氯甲烷溶液,v/v),10 mL不同浓度的孔雀石绿标准溶液,1 mL二甘醇溶液,以下按照1.2.1和1.2.2方法提取和净化,分别按照三倍信噪比和十倍信噪比测量最低检出限和定量限,分别为2.0 μg/L和 5.0 μg/L,检出限和定量限符合要求.

加标后水样的色谱图见图3,回收率和相对标准偏差计算结果见表2.3个添加水平的孔雀石绿平均加标回收率为72.3%~83.8%,相对标准偏差在5.36%~6.15%之间,所述方法可用于池塘水中孔雀石绿的检测.

图3 加标鱼样的液相色谱-荧光检测图谱

表2 孔雀石绿加标回收率

3 结论

采用乙腈/二氯甲烷(1:1, v/v)提取和PRS柱净化后液相色谱-荧光法检测养殖淡水中孔雀石绿残留,孔雀石绿在0.002-1.0 mg/L范围内线性良好,相关系数为0.9999,最低检出限和定量限分别为2.0 μg/L和5.0 μg/L.平均加标回收率为72.3%~83.8%,相对标准偏差在5.36%~6.15%之间,该方法灵敏度高,适于养殖水体中孔雀石绿残留的分析检测.

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