非结核分枝杆菌菌种鉴定技术研究进展

曾旋 陆坚 徐宇翔 叶涛生

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是一种机会性致病菌，根据最新的原核生物名称术语数据库(http://www.bacterio.net)，已知NTM数量达190余种。其中，约1/3的菌种对人类具有致病性，可导致肺脏、淋巴结、关节、皮肤和软组织等重要组织器官感染并引起全身播散性疾病[1-2]。NTM的传播途径包括经空气、水、土壤等，同时，也有报道称奇美拉分枝杆菌(Mycobacteriumchimaera)通过手术室中支持体外心肺循环的加热器或冷却器感染心脏介入手术的患者[3]。在赞比亚、中国等国家，NTM在疑似结核病患者中的分离率分别为15.1%、5.4%～10.5%[4-5]；日本的分离率甚至高达27.5%，患病率为24/10万[6]。由于抗结核和抗NTM的药物治疗方案存在差异，使用抗结核药物治疗NTM病可完全无效，结果延误疾病诊治。因此，准确鉴定分枝杆菌菌属菌种是实现精准治疗的前提，具有重要的临床意义。笔者将就NTM鉴定技术进展进行综述。

一、传统细菌学鉴定法

传统细菌学鉴定主要基于分枝杆菌的形态和生理生化特征，包括萋-尼抗酸染色法、荧光显微镜检法、传统固体培养法，以及应用半自动培养系统、培养管式培养系统、全自动培养系统的快速培养法[7]。研究显示，应用培养系统的快速培养法平均报告时间为13.3～16.9 d，较固体培养基法的21.7 d缩短，差异有统计学意义(P<0.001)[7]。Azadi等[8]总结了65篇对分枝杆菌鉴定的论文，发现痰涂片的敏感度为20%～70%，特异度为95%～98%；培养的敏感度为95%，特异度为98%。目前，分枝杆菌的分离培养仍是诊断分枝杆菌病的“金标准”，且是不同方法学应用评价的参照标准。然而上述方法特异度低，不能将亲缘关系密切的分枝杆菌菌种进行准确鉴定。同时，缓慢生长的分枝杆菌形成菌落需8～12周的时间，不利于临床快速诊断。

二、菌体组成成分鉴定

基于菌体组成成分的NTM菌种鉴定方法主要包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、免疫层析技术和色谱技术。MALDI-TOF-MS主要是根据菌体蛋白，在磁场的作用下产生不同的轨迹光谱，并与数据库中的光谱进行比对而得出菌种鉴定结果，具有高效、可靠、廉价的特点。目前，德国布鲁克·道尔顿平台最近更新的分枝杆菌库V5.0版本共含有853个光谱，可鉴定159种分枝杆菌。法国梅里埃公司的 v4.12 RUO数据库包含了1286个光谱，可鉴定45种分枝杆菌[9]。MALDI-TOF-MS鉴定菌种的准确性与物种的亲缘关系和参考光谱的覆盖程度相关。Rodriguez-Temporal等[10]对240株NTM临床分离株进行鉴定，比较了分别应用3.0版和2.0版分枝杆菌库(德国布鲁克·道尔顿平台)的MALDI-TOF-MS法和PCR反向杂交法鉴定的准确性，结果发现3.0版对192株(80%)分枝杆菌准确鉴定至35个菌种，比2.0版多鉴定出15株NTM，并且差异有统计学意义；PCR反向杂交法对175株(72.9%)菌株准确鉴定至20个菌种。从而得出了MALDI-TOF-MS比PCR反向杂交法更能准确鉴定NTM菌种的结论。另一项研究分别使用MALDI-TOF-MS法、PCR法和DNA-DNA杂交法对75株NTM进行鉴定，结果发现MALDI-TOF-MS法能准确鉴定产黏液分枝杆菌(Mycobacterium mucogenicum)，而上述其他方法则不能[11]。此外，根据菌体成分设计的检测技术还有基于结核分枝杆菌复合群MPB64分泌蛋白的免疫层析技术和基于菌体脂肪酸、分枝杆菌酸成分的色谱技术。

三、分子生物学技术

随着分子生物学技术的发展，目前对NTM进行菌种鉴定开展的分子生物学技术项目主要包括PCR-测序、PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)、实时荧光定量PCR、分子线性探针杂交技术(molecular line probe assay，LPA)、PCR-反向斑点杂交法、基因芯片技术、全基因组测序等。下文将对不同方法的实验原理及其菌种鉴定报道进行简述。

1.PCR-测序：该技术主要依赖生物遗传结构的多样性，对特定的靶基因通过PCR进行扩增后，将扩增产物片段进行测序，并与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)数据库中的序列进行比对，最终得出菌种鉴定结果。目前常选用的靶基因包括rrs、ITS、hsp65、groES、recA、rpoB、dnaJ、oxyR、pncA、rnpB、sodA、gyrB、secA1。上述基因编码产物分别为16S rRNA、转录间隔区域、热休克蛋白-65、10-kDa伴侣蛋白、重组蛋白、DNA-定向RNA聚合酶β链、伴侣蛋白、过氧化氢诱导基因激活物、吡嗪酰胺酶/烟酰胺酶、核糖核酸酶P催化亚基、过氧化物歧化酶、DNA旋转酶B亚基、前蛋白转位酶[12]。韩国的Kim和Shin[13]选取16srRNA、hsp65、rpoB等3个基因片段，设计引物后分别对临床分离的109株菌株提取DNA，进行PCR、测序和序列比对，结果发现上述3个基因分别将71.30%、86.79%和81.55%的临床分离株鉴定至菌种水平，3个基因联合分析时鉴定率为97.50%。由于某些基因片段在不同NTM中同源性高，不能准确鉴定至菌种，因此，同时分析多个基因片段进行菌种鉴定是有必要的。

2. PCR-RFLP：该方法结合了PCR扩增和限制性分析，常选取hsp65、rpoB、16SrRNA、ITS基因进行扩增，并通过限制性内切酶酶切，进行凝胶电泳后得到不同限制性片段谱带，可结合软件分析电泳图谱，进行菌种鉴定和同源性分析，具有简便、快速、准确、廉价的特点[14-15]。Nour-Neamatollahie等[14]以hsp65基因为靶基因，用限制性内切酶Cfr13Ⅰ(Sau96Ⅰ)和 BstHHⅠ(CfoⅠ)对294 bp的扩增产物片段进行酶切，发现该方法对结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex，MAC)进行鉴定的特异度和敏感度均为100%。黄明翔等[16]选取rpoB为靶基因进行扩增后，单一应用限制性内切酶HaeⅢ可鉴定18种NTM，单一应用限制性内切酶MspⅠ可初步鉴定54种NTM，两者联合可将77种NTM鉴定至具体菌种。由此可见，联合应用限制性内切酶进行菌种鉴定也有利于提高准确性。

3.实时荧光定量PCR：基于核酸检测的实时荧光定量PCR可应用荧光共振能量转移(FRET)探针、分子信标或TaqMan探针技术来对封闭系统中的扩增产物进行连续检测，具有低污染风险和同时识别多个目标的优点[17]。此外，还有应用肽核酸(PNA)探针的实时荧光定量PCR检测。PNA是用不带电的肽骨架人工合成的DNA类似物，具有良好的杂交性能和稳定的化学、热、生物性能。Choi等[18]为了评估PNA 探针实时PCR在检测分枝杆菌复合体(MTBC)和NTM时的应用，以培养法作为金标准，发现该方法对MTBC检测的敏感度和特异度分别为96.7%(58/60)和99.6%(469/471)，对NTM的敏感度和特异度分别为69.0%(29/42)和100.0%(489/489)。

4.LPA：该方法又称PCR-单链探针反向杂交试验，目前该检测方法包括比利时Innoge-netics公司分子线性探针法(INNO-LPA)、德国Hain Lifescience公司GenoType MTBDRplus法、自身免疫性诊断结核分枝杆菌耐药分子线性探针法和反向杂交结核分枝杆菌耐药分子线性探针法[19-20]。其中，GenoType MTBDRplus法又称Hain test，目前临床应用广泛。该方法采用商业试剂盒(CM/AS)，CM试剂盒可以识别15种分枝杆菌，包括结核分枝杆菌，而AS试剂盒则鉴别另16种不太常见的NTM。上述试剂盒的原理为针对23S rRNA基因区域的DNA扩增，然后与固定在膜条带上的特异性寡核苷酸探针进行反向杂交，以鉴定菌种[21]。Singh等[21]采用Hain test并使用CM/AS试剂盒对60株NTM进行鉴定，发现58株(96.7%)NTM被正确鉴定。

5.PCR-反向斑点杂交法：该方法是利用生物素等标记的探针和特异性扩增PCR产物(靶DNA序列)杂交快速检测某基因的测试，并通过显色鉴定菌种。Wu等[22]对27株分枝杆菌标准株和340株临床分离的分枝杆菌作为研究菌株，比较了PCR-反向斑点杂交法、传统鉴定方法和测序鉴定菌种的准确性，发现PCR-反向斑点杂交法与测序鉴定菌种相比较，其准确率达99.1%。

6.基因芯片技术：该技术是在一块基片表面固定序列已知的靶核苷酸的探针，利用核酸探针杂交的原理，与提取的菌种核酸扩增产物且被扩增为带有荧光分子的 DNA片段进行杂交，通过荧光显色而进行菌种鉴定，具有快速、灵敏、特异的特点。唐曙明等[23]选取ITS建立的基因芯片技术对23种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株鉴定，特异度为100%。Srilohasin等[24]则基于51个单核苷酸多态性基因位点(SNPs)开发的基因芯片，拥有99.85%的基因分型检出率，100.00%转化率，99.75%的再现率，99.85%的准确率，能够在6 h内检出MTBC，显示出该技术的简单、灵活、快速。此外，还有基于gyrB、16SrRNA等基因的核苷酸序列开发的基因芯片技术[25]。

7.全基因组测序：自从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)发展至今，已出现第四代测序技术[26]。目前用于菌种鉴定的全基因组测序技术为二代测序技术，作为菌种鉴定的“金标准”，该技术存在花费高、耗时长的缺点，主要用于科学研究，不利于临床应用[27]。

四、展望

目前，传统鉴定技术存在敏感度低、耗时长的缺点，然而，由于其花费低，仍被广泛应用于临床。与传统鉴定方法相比，MALDI-TOF-MS和分子生物学技术已大大提高NTM鉴定的准确率，其中MALDI-TOF-MS、实时荧光定量PCR、LPA、基因芯片等方法已在大型医院或结核病专科医院应用，但仍存在仪器设备价格昂贵或技术要求高等缺点，不利于充分推广。未来，建立一种快速可靠、成本低廉、操作简便的标准化体系是鉴定NTM的趋势。