廊坊池塘工程化循环水养殖池塘微生物多样性分析

张修建

摘要：为了探索和研究池塘工程化循环水养殖过程中微生物种群对养殖水质的影响，在廊坊循环水试验池塘主养草鱼成鱼和大鳞鲃成鱼的 2个水槽中的微生物开展了微生物多样性分析研究。在养殖箱体进水口、集污区集污区底部沉积物、填料附着物分别采集10个样品，分成4组，并进行微生物样品对比分析。通过检验，初步掌握了微生物种群变化情况。分析表明，投放填料浮球对水质改善有一定的贡献，对消除有害物质、降低水体污染，减少能耗，实现池塘高效低碳养殖具有积极贡献。

关键词：微生物;工程化循环水;浮球;菌群

近年来，随着淡水养殖规模日益扩大，池塘单产不断提高，排入水中的有机物含量高，氮磷总量相应增加，造成水体富营养化，这样的水排入环境中，容易造成污染，因此，寻求一个高效科学健康的治理养殖水污染的措施或更加可持续发展的养殖模式是亟待解决的问题[1]。为大力开展现代水产养殖技术集成和模式创新，廊坊市水产技术推广站引进池塘工程化循环水养殖模式，在永清县右奕营村5亩池塘中建设循环水养殖水槽，同时，针对池塘工程化循环水养殖模式发展需要，开展了池塘微生物多样性的相关研究，以池塘工程化循环水养殖系统为核心，在养殖箱体集污区内投放填料浮球，浮球内充填料物为过滤海绵。通过对箱体内不同区域水质及填料浮球附着物定期生物检测，并进行微生物样品对比分析，为消除水体环境污染，降低能耗，实现池塘高效低碳养殖提供科学的理论依据。

1样品采集

分别在7月15日、8月15日和9月15日在养殖池中进行采样，采样分组情况如表1所示。

2样品检测

2.1DNA提取、PCR和高通量测序

水样带回实验室之后先在通风橱中进行抽滤，将滤膜用灭菌的手术刀剪碎，利用DNA试剂盒提取总DNA。进行PCR扩增（C，T = Y;G，A，T = D;A，C，G = V;A，C，G，T =N）。采用MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序。

2.2测序数据的筛查与处理

运用QIIME软件识别疑问序列。随后，通过QIIME软件调用USEARCH检查并剔除嵌合体序列获取高质量的数据。

2.3OTU划分与分类地位鉴定

通过QIIME软件调用UCLUST序列比对工具，按97%的相似度进行序列归并和OTU划分（见表2）。

2.4菌群多样性及分类组成分析

Alpha 多样性分析反映的是单个样品中的物种多样性。进行菌群稀疏曲线分析、群落丰度指数分析（Chao1指数和ACE指数）、菌群多样性指数分析（香农指数（Shannon）、辛普森指数（Simpson）），综合评价细菌Alpha多样性（见表3）。

通过样品测序序列计算各样品中细菌的多样性指数，由表3可知，进水口细菌群落7月、8月Chao1指数和ACE丰富度指数稳定，9月份水体Chao1指数和ACE丰富度指数最高，说明进水口细菌群落受外塘水体环境变化影响较大，池塘里鱼类排泄物及残体的存在，使得中上层的有机和无机物比较丰富，满足微生物所需营养，因此微生物群落比较丰富[2]。集污区细菌群落7月、9月Chao1指数和ACE丰富度指数均比进水口指数高，说明水槽集污效果明显。9月份集污区底部沉积物和生物填料附着物中Chao1指数分别为： 1 950.21、2 605.88， ACE豐富度指数分别为2 127.95、2 512.60，说明细菌群落丰富度最高。9月份生物填料附着物中香农指数和辛普森指数分别为8.12，0.980 967，说明生物填料附着物中水体菌群生物多样性最高，生物填料具有过滤作用，能降低水体污染。

2.5养殖水体细菌菌群分类学组成分析

将每个注释上的物种归类于不同的分类水平，并将 OTU 在不同样品中的序列数进行整理分析（见表4），如A1门OTU中鉴定到门的有25个，A1属OTU种鉴定到种的有66个，依次类推。

2.5.1基于门分类水平进行分析通过序列比对和注释，并通过利用QIIME软件，将对三种水体中的微生物在门和属水平上的分类及相对丰度进行统计分析，在7月15日、8月15日和9月15日这3个月份的进水口样品中A1、A6和A10 丰度值依次是：Actinobacteria（放线杆菌门）（0.38/0.35/0.33）、Proteobacteria（变形菌门）（0.29/016/0.24）、Cyanobacteria（蓝藻门）（0.08/0.32/0.21）、Bacteroidetes（拟杆菌门）（0.09/0.07/004）、Planctomycetes（浮霉菌门）（0.08/0.07/0.03）.由3个月份进水口相比较而言8月份的A6进水中蓝细菌门的丰度最高，因8月份是暑期高温时间，蓝细菌门成为优势菌群;变形菌门丰度最低。

在7月15日、8月15日和9月15日这3个月份的集污区样品A2、A3和A7丰度值依次：Actinobacteria（0.03/0.36/0.38）、Cyanobacteria（0.09/0.37/0.19）、Proteobacteria（0.25/0.11/0.23）、Planctomycetes（0.15/0.06/0.05）、Bacteroidetes（0.08/0.04/0.06）、Verrucomicrobia疣微菌门（0.03/0.01/0.04），由此可知8月份出水口的蓝细菌门丰度最高，变形菌门丰度最低。

在8月15日和9月15日集污区底部沉积物A4和A8样品丰度值依次是：Proteobacteria（038/0.22）、Firmicutes厚壁菌门（0.06/0.19）、Chloroflexi绿弯菌门（0.18/0.02）、Actinobacteria（0.02/0.16），集污区底部沉积物9月份相比较于8月份变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门呈现降低趋势，厚壁菌门和放线杆菌门呈现增长趋势。

在8月15日和9月15日生物填料附着物A5和A9样品丰度值依次是：Proteobacteria（052/0.22）、Bacteroidetes（0.18/0.15）、Actinobacteria（0.08/0.12）、Firmicutes（0.01/0.11）、SR1（Absconditabacteria）（0.002/0.10），生物填料附着物样品与8月份样品相比较在9月份时变形菌门呈现降低趋势，厚壁菌门和Absconditabacteria呈现增长趋势.同时也可以看出生物填料可以聚集有利优势菌群。

2.5.2基于属水平分析在7月15日、8月15日和9月15日这3个月份的进水口样品中A1、A6和A10 丰度值依次是：hgcI-clade（0.13/019/0.17），CL500-29marine group（0.1/0.1/0.1）、Prochlorococcus原绿球藻（0.03/0.19/014）、CL500-3（0.07/0.07/0.02）、Mycobacterium分支杆菌属（0.05/0.01/0.05）、

Prochlorothrix原绿发藻属（0.003/0.06/003）、Acidibacter食酸菌属（0.02/0.01、0.03），与7月份和9月份相比较8月份的hgcI-clade、原绿球藻和原绿球藻属呈现增长趋势，分枝杆菌属呈现降低趋势;CL500-3与7月份和8月份相比较在9月份时丰度最低。

在7月15日、8月15日和9月15日这3个月份的集污区样品中A2、A3和A7丰度值依次是：hgcI-clade（0.1/0.19/0.07）、CL500-29 marine group（0.08/0.11/0.11）、Prochlorococcus（0.02/0.17/0.09）、CL500-3（0.14/0.05/002）、Mycobacterium（0.04/0.01/0.06）、Prochlorothrix（0.0005/0.04/0.03），与7月份和9月份相比较8月份时hgcI-clade、原绿发藻属、CL500-29 marine group和原绿球藻属呈现增长趋势，和分枝杆菌属呈现降低趋势但是在9月份时丰度又有所增加，CL500-3在9月份的丰度最低。

在8月15日和9月15日集污区底部沉积物A4和A8样品丰度值依次是：Tabrizicola（0.07/0.006）、Arcobacter弓形菌属（0/0.06）、Prochlorococcus（0.01/0.05）、鲸杆菌属（0.02/0.03）、Mycobacterium分枝杆菌属（0.000 6/0.04）、Lysobacter泥杆菌属（0.04/0.000 25）、Nitrospira硝化螺旋菌属（0.04/0.000 035）、Flavobacterium尼龙菌属（0.03/0.000 21）集污区底部沉积物9月份相比较于8月份Tabrizicola呈现降低趋势在9月份时甚至低于了0.1%。弓形菌属、原绿球藻、鲸杆菌属、分枝杆菌属、泥杆菌属、硝化螺旋菌属、尼龙菌属呈现增加趋势。

在8月15日和9月15日生物填料附着物A5和A9样品丰度值依次是：Sediminibacterium沉积杆菌属（0.01/0.000 04）、Tabrizicola（0.11/0.000 03）Acetobacteroides醋酸杆状菌属（0.000 5/0.11）、Mycobacterium（0.02/0.04）、Rhodobacter红杆菌属（0.05/0.000 36）生物填料附着物样品与9月份样品相比较在8月份时醋酸杆菌属和分枝杆菌属呈现增长趋势，沉积杆菌属和Tabrizicola迅速降低甚至低于0.1%。生物填料起到了大量富集有益微生物的作用。

2.6水体菌群差异性分析

通过上述各菌群分类水平分析已经初步表明各种水体微生物群落结构是不同的。为了进一步分析样品间菌群群落复杂度的差异，利用 QIIME（Version1.50）平台下基于UniFrac距离对样品差异性进行分析，在3个月份的进水口样品A1、A6和A10 进水口中菌群结构受主成分PC1影響最大，占总影响因子的64.22%，主成分 PC2占总影响因子的35.7%，主成分PC1和PC2三种主成分对样品中菌群结构的影响程度达到总影响因子的99.92%。结果发现采用Unweighted（不考虑OTU丰度）的计算方法进行主成分分析知道灰水重复性最高。从UPGMA 聚类树分析知A1和A6两次的进水口的菌群差异性较小，而A10与这两次的水体中的菌群差异性较大;在三个月份的进水口样品A2、A3和A7 出水口中菌群结构受主成分PC1影响最大，占总影响因子的5625%，主成分 PC2占总影响因子的43.75%，主成分PC1和PC2三种主成分对样品中菌群结构的影响程度达到总影响因子的100%.从UPGMA 聚类树分析知A2和A3两次的进水口的菌群差异性较小，而A7与这两次的水体中的菌群差异性较大。

2.7菌群代谢功能预测

氨基酸代谢的菌群数量多也就说明有更加多的微生物分解有机氮，碳水化合物代谢菌群数量大可以帮助水体分解糖类等物质，避免造成水体富营养化，使得箱体内保持一个较好的水环境，有利于养殖。

3检测结果

进水口和出水口采样时间为7、8和9月，在3个月份中进水口和出水口统计出的OTU数都是9月份最高，集污区底部沉积物和生物填料附着物采样时间为8、9月，两者都是在9月份OTU数量最高，说明微生物物种数呈现出明显的季节变化，与池塘水温相关，同时也可能与养殖周期所处的阶段有关，9月处于养殖后期，而7月和8月处于养殖中期。

从门水平分析，进水口和出水口微生物优势类群均为Actinobacteria（放线杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Cyanobacteria（蓝藻门）。生物填料附着物和集污区底部沉积物共同的微生物优势类群有Proteobacteria、Firmicutes厚壁菌门、Actinobacteria。说明水处理系统中生物填料的微生物种类组成与集污区底部沉积物相似，同时进水区和出水区的微生物种类组成相似，说明经水处理后并未改变水体中微生物的组成。

从生物填料附着物的微生物多样性指数分析，9月份的Chao1指数和ACE微生物丰度指数明显高于8月份，微生物数量明显升高，同时9月份的香农指数（Shannon）、辛普森指数（Simpson）指数也高于8月份，说明微生物的多样性增加。上述结果证明生物填料对养殖水体菌群起到了明显的富集和增殖效果。

从所有的微生物样品分析，菌群代谢功能集中于氨基酸代谢、糖类代谢和能量代谢，原因可能是水体中的粪便和残饵富含较多的有机氮和糖类，水体中微生物上述的菌体代谢功能有助于清除水体环境污染特别是其中的有机污染物。

水体或沉积物中的优势菌群中未发现病原菌。

参考文献：

[1]

李建柱，侯杰，张鹏飞，等.空心菜浮床对鱼塘水质和微生物多样性的影响[J].中国环境科学.2016，36（10）：3071-3080.

[2] 李晓，李冰，董玉峰，等.精养团头鲂池塘沉积物微生物群落的结构特征及组成多样性分析[J].水产学报，2014，38（2）：225.